赛箔科研成果分享：《Biofabrication》生物3D打印构建糖尿病视网膜病变模型
简介
糖尿病视网膜病变（DR）是一种常见的糖尿病微血管并发症。高血糖可引起视网膜结构改变、激发炎症反应和上调血管生长因子水平，最终导致视力损害甚至失明。大约20%的患者对抗血管内皮生长因子（VEGF）药物治疗反应不佳，急需寻找其他的解决方法。来自复旦大学附属眼耳鼻喉科医院邬海翔团队、上海中医药大学汤忞团队和赛箔生物技术人员采用DLP光固化生物3D打印技术构建了内皮细胞（ECs）和小胶质细胞（MGs）在不同葡萄糖条件下的三维共培养模型，用以模拟发生在糖尿病视网膜病变时的视网膜微血管改变。相关论文《3D Bioprinted Endothelial Cell-Microglia Coculture for Diabetic Retinopathy Modeling》近日发表于《Biofabrication》（IF: 11.061）。
作者发现较高浓度的葡萄糖水平能够影响ECs和MGs的表型、基因表达和血管生成潜能。葡萄糖浓度从5 mM（正常血糖水平）增加到25 mM（高血糖），单独培养的EC中，抗VEGF药物阿柏西普的药效降低了17%；共培养ECs-MGs，阿柏西普和康柏西普的药效分别降低了25%和30%，这表明糖尿病的高血糖状况和小胶质细胞的存在可能会干扰药物反应。这些研究结果强调了细胞间相互作用和微环境因素在DR治疗中发挥的重要作用，为确定新的治疗策略和提高对小胶质细胞在疾病发病机制中作用的认识提供了新的模型和思路。
实验结果
本研究中，作者采用赛箔生物自主研发的Azure生物3D打印机，将细胞和光固化水凝胶材料按照一定比例混合后打印，用于研究DR中ECs和MGs的相互作用（图1）。由于MGs主要在视网膜丛状层中,发挥监视视网膜细胞的作用，水凝胶材料的硬度参照视网膜丛状层的硬度进行设计。在不同葡萄糖浓度条件下，单独打印和培养ECs和MGs在day3时随着葡萄糖浓度水平的升高，增殖减少（图1d-e），而在共培养模型中，表现为更高的细胞增殖状态（图1-f）。
图1. 研究工作示意图及实验条件筛选结果
作者利用三种葡萄糖浓度条件开展下一步研究：5.5mM（G5.5）模拟人体生理环境，10mM（G10）、25Mm（G25）模拟DR疾病环境。作者发现这三种糖浓度下，单独培养和共培养细胞的活率都保持在90%以上（图2）。
图2 单培养和共培养细胞存活率
共打印模型中的ECs同样具有较好的成管能力，G5.5条件下相比G10、G25能够形成更完整的网状结构（图3）。
图3 共培养条件下内皮细胞的性能
同时，共培养模型中的MGs，在G10、G25条件下检测到较高的IBA-1表达，表现为阿米巴样的形态改变，表明小胶质细胞在较高浓度的葡萄糖水平下可处于激活状态（图4）。
图4 共培养条件下小胶质细胞的性能
作者利用RNA-seq分析G5.5条件下单独培养和共培养模型中ECs和MGs的基因表达情况，发现共培养后，两种细胞的基因表达情况发生了显著的变化。GO分析揭示了不同的基因表达变化模式，验证了共培养体系为ECs和MGs提供了更仿生和更复杂模型的假设。作者同时研究了相较于生理条件（G5.5组），高糖（G10组、G25组）对ECs和MGs共培养的影响，揭示了生理和疾病状态之间基因表达谱更显著的差异，突出了糖尿病高糖环境对细胞过程和通路的实质性影响。
最后，作者使用生物3D打印模型进行药敏试验，评估目前临床上用于治疗DR的常用抗VEGF药物，包括阿柏西普、康柏西普和雷珠单抗。作者构建了ECs单培养、MGs单培养和ECs-MGs共培养三种生物打印模型，并在G5.5、G10和G25三种不同葡萄糖浓度下测试药物。发现共培养模型中，三种药物在G10组和G25组的疗效降低(图5)，表明MGs可能在高糖环境下对ECs发挥着保护作用。这提示在寻找抗VEGF药物的潜在耐药机制时，要充分考虑葡萄糖浓度和细胞间相互作用的影响。
图5 药敏试验
结论和未来工作
该研究成功建立了一个具有模拟视网膜力学性能的3D生物打印共培养模型，为研究DR患者在不同葡萄糖条件下ECs和MGs之间的相互作用提供了一个有价值的平台。该研究发现，共培养模型对糖尿病条件下的细胞增殖具有保护作用，强调了MGs在促进细胞增殖和调节ECs行为方面的潜在作用。在高糖条件下，共培养模型中的MGs显著激活，IBA1表达明显，形态变化明显，为不同葡萄糖浓度情况下MGs在组织重塑、修复过程和免疫反应中的动态作用提供了新的见解，也为研究MGs表型的异质性提供了强大的和通用的工具。
此外，该研究对共培养模型耐药性的研究揭示了当前DR治疗的局限性。较高的葡萄糖浓度条件下，常用抗VEGF药物，如阿柏西普、康柏西普，在共培养模型中的有效性下降，这强调了寻找解释细胞间相互作用和微环境创新思路的迫切性。
相信未来利用这一模型开展的研究有望进一步揭示DR的潜在机制，以寻找到更有效的治疗方法。这不仅能够克服抗VEGF药物的耐药性，还可以增强对DR病变机制的理解，为改善患者的预后铺平道路。
原文链接：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acfb3（文末点击“阅读原文”可跳转文章链接）
关于赛箔生物
赛箔生物致力于开发生物3D打印、生物材料、体外检测组织产品、再生器官产品，并且基于相关产品开发精准的检测评价方法及服务。目前已开展数百例肿瘤临床样本的生物3D打印微组织构建，经过大量实验研究及一致性验证，能够构建与患者组织高度一致的肿瘤微组织用于药敏检测，涵盖癌种包括肺癌、结直肠癌、脑胶质瘤、神经母细胞瘤、肝母细胞瘤、膀胱癌等高发癌种、难治肿瘤、儿童肿瘤，成功率>90%，可实现1-2周内完成采样至完成药敏检测流程。
生物3D打印技术，是一项前沿生物制造技术，能够用于制造例如类器官、器官芯片等具有不同尺寸规格、复杂程度的体外3D细胞组织模型。结合与人体组织高度相似的仿生生物材料及患者细胞，可以精确地复制患者肿瘤组织的细胞及细胞外基质特征。通过生物3D打印建立的肿瘤微组织与患者肿瘤组织中突变基因及突变类型保持高度一致。作为一项工程技术，能够更高效率、批量化地建立高重现性、高精度的模型。这些优势都使得生物3D打印技术在肿瘤精准医疗研究和临床应用中具有巨大的潜力。
生物3D打印构建流程
通过生物3D打印建立的肿瘤微组织，可以为患者提供个体化的治疗方案药物敏感性检测，包括类器官可检测的化疗药物、靶向药物。同时，在多种癌种，包括肺癌、结直肠癌等癌种中，生物3D打印为组织中可检测出较高比例免疫细胞，同时由于生物3D打印可以进行不同细胞组合的微组织模型制作，因此也可进行免疫治疗药物的检测，更好地满足患者的需求。
光固化生物3D打印后细胞存活率高、
并维持在体特性
如选择通过生物3D打印技术建立肿瘤微组织，大部分注意事项可参考专家共识针对肿瘤类器官的注意事项，此外运输时间方面相对类器官较为宽裕。目前样本质量、体积达标的情况下，在24小时内送达，均可实现>90%的构建成功率。
生物3D打印作为一种生物制造技术平台即将迭代为一种重要的生命科学工具，利用工程技术构建和模拟人体组织微环境，可涵盖包括类器官、器官芯片等3D模型的制造，从而代替动物实验。在药物研发临床前研究与评价的应用日趋明朗。
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