《Cell》：Osr2作为生物力学检查点，加剧肿瘤中CD8 T细胞的耗竭

作者首先探究了机械应力是否能够加剧TME中CD8+ T细胞耗竭。在图A中，作者观察到实体瘤的致密纤维化基质胶原区域表现出比低胶原蛋白表达区域更高的硬度。在人肝细胞癌（HCC）进一步观察，如图B、C所示，作者发现胶原蛋白高度沉积区域，T细胞高表达PD-1和TIM-3，这是晚期耗尽的CD8+ T细胞的标志物，这是晚期癌症的标志物。

为了确定机械力信号 (MFS) 是否调节 T 细胞耗竭，作者利用PDMS凝胶建立不同硬度的体外实验模型，该模型利用抗H2Kb抗体将T细胞紧密粘附在培养表面，并用抗CD3加抗CD28抗体诱导耗竭CD8+ T细胞（TEX）形成，流程如图D所示。

作者发现，使用的不同基质硬度的水凝胶对幼稚T细胞活化没有显著影响，考虑到CD8+ T细胞耗竭是由慢性 T 细胞受体 (TCR) 激活，因此作者使用抗 CD3、CD28 加白细胞介素 (IL)-2 预处理 T 细胞 48 小时，再应用 PDMS 凝胶诱导 T 细胞耗竭。实验结果如图E所示，在高硬度 (200 kPa) PDMS 凝胶上重新刺激活化的 CD8+ T细胞导致功能性 T 细胞出现显著的耗竭，表现为 IFNγ+TNFα+ 细胞百分比最低，而 PD-1+TIM-3+ 细胞百分比最高，说明高环境刚度可以促进 CD8+ T 细胞耗竭。

Piezo家族是机械力敏感通道中的一种，由于RNA 测序显示 Piezo1 在激活的 CD8+ T 细胞中高度表达。所以作者测量了在不同硬度的 PDMS 凝胶上培养的 CD8+ T 细胞中 Piezo1 介导的 Ca2+ 信号，结果如图F所示，作者发现在最高硬度的 PDMS 基质上培养的活化 CD8+ T 细胞中 Ca2+ 流入增强，并且如图G、H所示，使用Piezo1抑制剂GsTMx4或肌球蛋白抑制剂Blebbistatin进行治疗可以阻断机械信号传导进而减弱T细胞耗竭，同时如图I所示，敲除Piezo1或使用缺Ca2+培养基也可以获得类似的作用。表明 CD8+ T 细胞能够通过 Piezo1 受体对底物刚度做出反应。此外，如图J所示，在硬基质上培养的 Piezo1 缺陷型 CD8+ T 细胞显示出比野生型 (WT) CD8+ T 细胞更强的细胞毒活性。

为了测试体内 Piezo1 对 CD8+ T 细胞的功能，将Piezo1fl/fl和Piezo1△Lck CD8+T细胞等量混合并过继转移到接种MC38-OVA肿瘤细胞的野生型小鼠中，并在转移后 14 天评估 T 细胞的激活状态，如图L所示，与 Piezo1fl/fl 细胞相比，Piezo1△Lck 细胞在肿瘤中的频率显着增加，在脾脏和引流淋巴结中的频率稍高。图M的进一步分析结果显示，Piezo1△Lck 细胞表现出 Ki-67+ 细胞比例增加和凋亡细胞频率降低，这可能是肿瘤中 Piezo1△Lck T 细胞比例增加的原因。一致地，图N中，敲除Piezo1 导致 IFNγ+TNFα+ T 细胞的比例增加，而 LAG-3+ 或 PD-1+TIM-3+ T 细胞的比例下降。 总而言之，这些数据表明 Piezo1 介导的 MFS 增强了 CD8+ T 细胞的耗竭。

为了探索 MFS 促进 CD8+ T 细胞耗竭的下游调节因子，作者对用或不用 Yoda1处理的抗CD3、CD28 激活的 CD8+ T 细胞进行了 RNA-seq 分析。如图A所示，在 Yoda1 处理的样本中一系列 CD8+ T 细胞细胞毒性特征基因，如 Prf1、Gzmb 和 Ifng显著下调，表明 Yoda1 介导的机械刺激降低了 CD8+ T 细胞的细胞毒性。值得注意的是，Osr2（一种既未在 T 细胞中表征也不与 MFS 相关的 TF）是响应 Yoda1 治疗而上调最多的基因之一。接下来作者在qPCR、流式结果均论证了这一点，结果如图B，在 Yoda1 处理后在 CD8+ T 细胞被诱导，但在 Piezo1 缺陷的 T 细胞中未诱导，表明 Piezo1 信号传导可以诱导激活的 CD8+ T 细胞中的 Osr2 表达。

因此，作者推测对 CD8+ T 细胞施加机械力也可以诱导 Osr2 表达。随后作者在细胞拉伸装置和体外培养模型证实了这一点，如图C、D所示，机械力可诱导 Osr2 表达。此外，作者探索了诱导Osr2所需的条件，如图E，结果表明，缺乏 MFS 或 TCR 均不能有效诱导 CD8+ T 细胞上的 Osr2 表达。因此，激活Piezol的机械信号与TCR信号是已活化的CD8+T表达Osr2的必要条件。

接下来作者试图确定 MFS 如何调节活化 T 细胞中的 Osr2 表达。对经 Yoda1 或 DMSO 处理的 CD8+ T 细胞进行高通量测序 (ATAC-seq) 分析转座酶可及染色质，结果如图F，显示了3,360 个差异可及峰，其中包括Osr2和其他T细胞功能相关基因的区域。与Osr2 mRNA水平高度一致，图G结果表明，Yoda1 处理增加了 Osr2 多个位点的染色质可及性。作者进一步分析了TF基序分析，图H结果表明，荧光素酶测定中CREB1是诱导Osr2启动子介导的荧光素酶活性最强的转录因子。一致地，图I结果说明，Yoda1处理增强了CREB1和P300与活化CD8+T细胞中Osr2位点的DNA结合活性，并且图J能够看到，敲低CREB1，显着降低了活化CD8+T细胞中Yoda1诱导的Osr2表达。

在先前的工作中，作者已经证明Piezo1 激活巨噬细胞中的 Ca2+、钙调蛋白依赖性激酶 II (CaMKII)，图K中Yoda1 处理显著增强了活化 CD8+ T 中的 CaMKII 磷酸化和 CREB 磷酸化 ，并且去除细胞外钙离子有效抑制了 Yoda1 诱导的 CaMKII 和 CREB 磷酸化。此外，如图M、L所示，CaMKII 抑制剂（KN-93）的治疗可减弱 Yoda1 诱导的 CREB 磷酸化和活化 CD8+ T 细胞中的 Osr2 表达。综上，机械激活的Piezo1通过Ca2+-CaMKII-CREB轴调节活化的CD8+ T细胞中Osr2的表达。

为了研究 Osr2 是否参与 MFS 介导的衰竭CD8+T诱导，作者生成了 T 细胞特异性 Osr2 敲除小鼠，Osr2 对幼稚 T 细胞发育和激活的影响较小。然而，如图A所示，当用体外培养模型培养激活的 Osr2fl/fl 和 Osr2△Lck T 细胞时，Osr2 缺失显著阻断 IFNγ + TNFα + 细胞下调，并减弱 PD-1 + TIM-3 + 衰竭T细胞的诱导。体内实验中，如图C、D所示，Osr2 缺失导致肿瘤浸润 CD8+ T 细胞频率更高，细胞增殖增强，凋亡减少，观察到较高IFNγ + TNFα +细胞百分比和较低的 PD-1 + LAG-3+ 或 PD-1+ TIM-3 + TEX 细胞频率。并且如图E所示，与体外研究结果一致，在肿瘤中相比于表达Osr2的细胞，在缺失Osr2的细胞观察到较高百分比的 IFNγ+TNFα+ 和较低频率的 PD-1+LAG-3+ 或 PD-1+ TIM-3+ Osr2△Lck TEX 细胞。

此外，如图F、G在人类 HCC 组织的 I 型胶原蛋白高区域中观察到表达 Osr2 的 CD8+ T 细胞比例高于 I 型胶原蛋白低区域。这些结果表明 Osr2 是环境 MFS 的下游执行者，可增强 CD8+ T 细胞的耗竭。

作者在对转移后第14天的肿瘤浸润的Osr2fl/fl和Osr2△Lck OT-I T细胞进行转录谱分析，结果如图H，包括与效应功能相关的基因与耗竭相关的基因，进一步分析差异基因发现，与野生型相比，Osr2△Lck CD8 + T细胞中效应T细胞(相对于耗竭T细胞)上调或耗竭T细胞(相对于记忆T细胞)下调的基因集增强，并且大多数差异基因与T细胞活化和细胞杀伤的调节有关，结果如图I、J所示。综上所述，MFS诱导的Osr2促进肿瘤中T细胞耗竭。

然后，作者对来自上述小鼠浸润肿瘤的抗原特异性T细胞进行了单细胞测序。如图A、B所示，从4个样本的21581个细胞中分出7个主要簇，其中TEX分为3-7个簇。作者分析了7个簇的DEG，以定义亚群特异性转录特征。第1簇高表达效应记忆T细胞的特征性基因。第7簇主要表达细胞周期基因。第2簇由于表达Tcf7、Tox和Pdcd1，被定义为前体耗竭T细胞( TPEX )。第3-6簇表达的基因编码抑制性受体以及与耗竭相关的。第3簇表达Cx3cr1，是增殖暂时性TEX的标志。根据Pdcd1、Lag3、Havcr2、Id2和Tox水平的上调，将簇4、5和6分别分为中间、晚期和晚期TEX亚群。值得注意的是，如图C所示，Osr2 在簇 5 中特别富集。这在流式实验中也得到证实，在TME中，PD- 1+ TIM-3+ TEX细胞中Osr2的表达高于其他TEX亚群，结果如图D所示。此外，作者使用NetBID算法分析数据驱动的隐藏驱动因素，结果如图E所示，确定Tcf7和Bach2为TPEX的正调节因子，Xbp1、Prdm1和Maf为晚期TEX细胞的促进因子。Osr2在晚期TEX细胞中富集度最高，认为对T细胞耗竭起关键作用。为了确定 OSR2 表达水平是否与人类癌症中不同的 T 细胞耗竭状态和纤维化微环境相关，作者对来自高纤维化或低纤维化人类 HCC 样本的 CD8+ T 细胞进行了 scRNA-seq 分析。如图F、G所示，分析结果显示OSR2表达在HCC患者终末分化的TEX亚群中最富集，且高纤维化HCC中CD8+ T细胞的OSR2表达更为丰富，此外，如图H所示，从高度纤维化肿瘤中分离的 T 细胞含有更多终末分化的 TEX 细胞亚群，并且表达 OSR2 的 CD8+ T 细胞在高纤维化 HCC 中比在低纤维化 HCC 中更富集，此外，作者还对小鼠肿瘤的对照和Osr2缺陷的TIL进行了scRNA-seq分析，如图I所示，Osr2缺失导致末端TEX细胞亚群比例降低。综上，这些结果表明，Osr2在小鼠和人类肿瘤的肿瘤浸润PD-1 + TIM-3+晚期或终末TEX细胞中特异性富集。为了确定Osr2是否在病毒感染背景下在TEX细胞中被诱导，研究者用慢性或急性病毒感染小鼠，并测量脾脏硬度和脾P14 T细胞中的Osr2水平。如图J,脾脏僵硬几乎不受病毒感染影响，且在图K中可以看到两种感染期间分选的P14细胞中的Osr2水平均很低。此外，根据图M、L可以看出，在特定感染后的T细胞亚群中无法检测到Osr2相关的细胞类型。因此，研究结果表明，Osr2在TEX细胞中的诱导是特异性响应TME中的机械应力。

然后，作者在体外CD8+ T细胞中用逆转录病毒过表达了Osr2，结果如图A、B所示，在体内外逆转录病毒Osr2表达降低了CD8+T细胞中IFNγ+ TNFα +的产生，并且RNA-seq分析显示641个差异表达基因，如图C所示，过表达Osr2后效应子相关基因下调和幼稚特征上调。如图D所示， 许多关键的个体效应相关基因在体外被逆转录病毒介导的 Osr2 表达抑制，而耗竭基因被诱导。此外，基因集变异分析（GSVA）显示，如图E，结果显示，病毒感染期间活化T细胞上调的基因集在Osr2OE CD8 + T细胞中均被抑制，表明 Osr2 可能作为转录阻遏蛋白发挥抑制作用。

接下来，为了确定 Osr2 诱导的功能变化在体内是否持久，将 WT 或 Osr2OE P14 T 细胞转移到 LCMV Cl13 感染的小鼠中。实验结果显示，在LCMV Cl13感染的小鼠中，Osr2-OE P14 T细胞数量减少，且其效应T细胞频率降低，抑制受体表达增加，这些特征持续长达30天。此外，Osr2-OE OT-I细胞在肿瘤免疫中也表现出控制肿瘤生长能力受损，如F、G、H图所示，IFNγ+ TNFα+细胞出现频率较低，TEX细胞频率较高。Osr2的过表达消除了Piezo1fl/fl或Piezo1△Lck OT-I细胞的肿瘤控制能力差异，表明Osr2增强了体内T细胞的耗竭。

与效应T细胞相比，TEX细胞具有独特的表观遗传特征。通过ATAC-seq测定，如图AB所示，CD8+ T细胞过表达Osr2减弱了参与效应T细胞与记忆T细胞分化的相关基因的可及性，染色质上与耗竭T细胞相关位点的可及性增强。随后，作者使用了Osr2-Gal4荧光素报告基因细胞系，如图C所示，al4-Osr2的表达导致荧光素酶活性降低，这些发现表明，Osr2 可能作为转录抑制因子，在与耗竭和效应功能相关的基因位点诱导表观遗传程序。

因此，在后续实验中，作者探索了Osr2与哪些转录辅阻遏蛋白相互作用并抑制转录活性。在免疫293T细胞中Osr2的免疫共沉淀测定显示，Osr2可能与HDAC家族蛋白结合。CoIP和WB实验证实Osr2与HDAC3、HDAC5和HDAC6相互作用。如图E显示， CD8+ T 细胞中的 HDAC3 和NCOR1 形成复合物，图F则说明在 FLAG 标记的 Osr2 或对照逆转录病毒转导的 CD8+ T 细胞中使用针对 HDAC3 或 FLAG 的特异性抗体进行 Cut&Tag 实验的结果表明，Osr2 和 HDAC3 占据相似的染色质区域，并且在启动子区域上富集更多。

随后，对 Osr2 和 HDAC3 占据的结合位点进行 GO 富集分析，揭示了参与 T 细胞激活和分化的 Osr2-HDAC3 轴靶基因集，此外Osr2和HDAC3峰基础序列的分析揭示了它们的DNA结合基序高度一致。

体外Osr2-OE CD8+ T细胞的RNA-seq结果显示445个DEGs与Osr2和HDAC3共同结合峰相关，且HDAC3增加，H3K27ac信号减少。在这些基因中，下调基因多于上调基因，证实了Osr2作为转录抑制因子的作用。如图I，在 Osr2OE 和对照的CD8+ T 细胞中使用针对 HDAC3 和 H3K27ac 的特异性抗体进行 Cut&Tag 分析，结果表明，发现相比于对照组，HDAC3在Osr2结合位点的总体结合显著增加，而在Osr2结合位点的H3K27ac降低，提示Osr2在T细胞中作为转录抑制因子起作用。图J结果表明，H3K27ac信号随HDAC3增加而降低，编码细胞毒性介质的基因位点受影响。另外，图K表明，HDAC3抑制剂RGFP966处理过表达Osr2的CD8+ T细胞可削弱Osr2过表达对效应T细胞分化的抑制作用。这些结果表明，Osr2通过募集HDAC3下调H3K27ac信号，抑制细胞毒性基因表达，作为CD8+ T细胞细胞毒性程序的负调节因子。

为了确定消除肿瘤反应性 CD8+ T 细胞中的 Osr2 是否可以增强肿瘤免疫力，特别是在较硬的 TME 中，作者对接种肿瘤的小鼠移植CD8+ T细胞，结果如图B、C显示 与Osr2fl/fl OT-I细胞相比，Osr2△Lck OT-I细胞具有显著更好的抗肿瘤能力，减缓了肿瘤的生长速度。从图D、E的结果可以看出，与Osr2fl/fl OT-I细胞相比，Osr2△Lck OT-I细胞具有更好的抗肿瘤能力，且IFNγ+TNFα+效应T细胞更多，TEX细胞更少。

最后，为了确定缺失 Osr2 是否可以提高 CAR-T 细胞在实体瘤中的治疗效果，作者生成了 Osr2fl/fl 或 Osr2△Lck CAR-T 细胞并评估其体内控制肿瘤的能力。 结果如图G和H所示，与Osr2fl/fl T 细胞生成的 CAR-T 细胞相比，Osr2△Lck T 细胞生成的 CAR-T 细胞显著增强了肿瘤控制。并且，如图I-K所示，与Osr2fl/fl  CAR-T细胞相比，Osr2缺失的CAR-T细胞具有更高的存在频率，这与转移后15天肿瘤微环境（TME）中Ki-67+细胞水平升高、凋亡细胞减少密切相关，同时表现为IFNg+ TNFa+细胞比例增加，以及PD-1、TIM-3和LAG-3表达降低。上述结果表明，Osr2的缺失能够通过减轻TME中的T细胞耗竭，从而提高CAR-T细胞对实体瘤的治疗效果。

本文转载自公众号：本草墨源

文案：赵培媛｜排版：高怡

文献原文：10.1016/j.cell.2024.04.023

文献链接：https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)00448-3