《Bioactive Materials》：生物材料/生物墨水和挤出式生物打印

萨斯喀彻温大学生物医学工程系陈雄彪教授团队在《Bioactive Materials》期刊上发表综述“Biomaterials / bioinks and extrusion bioprinting ”文章介绍了生物墨水是生物材料和活细胞的配方，有时含有生长因子或其他生物分子，而挤出生物打印是一种新兴技术，用于应用或沉积这些生物墨水或生物材料溶液，以创建具有模仿天然人体组织或器官的结构和机械/生物学特性的三维 （3D） 结构。构建体的成功打印及其后续应用取决于配制的生物墨水的特性，包括流变学、机械学和生物学特性，以及印刷工艺。本文批判性地回顾了用于挤出生物打印的生物墨水和生物材料解决方案的最新进展，重点关注生物墨水的合成和表征，以及生物墨水特性对印刷过程的影响。还讨论了关键问题和挑战以及对未来研究的建议。

用于生物打印的生物材料溶液和/或生物墨水已从聚合物中广泛合成。聚合物是具有长链和高含水量的有机生物材料，因此能够提供水合组织样环境，支持细胞功能(包括细胞的粘附、增殖和分化)和组织再生。聚合物可以是天然的，也可以是人工合成的；天然聚合物具有支持细胞功能的内在能力，而合成聚合物通常是生物惰性的，但表现出强大而稳健的机械性能。

褐藻胶，又称海藻酸，是一种主要来源于褐藻的水溶性多糖。该家族天然聚合物由β - D -甘露糖醛酸( M )和α - L -古罗糖醛酸( G )组成。单体可以出现在连续的G -残基( G-blocks )，连续的M -残基( M-blocks )或交替的M和G -残基( MG-blocks )的聚合物块中。褐藻胶中含有不同量的G和M嵌段，分子量在50 ~ 10万k Da之间。海藻酸盐因其易于打印形成3D结构、与离子交联的相容性、吸水性和低成本而被广泛应用于挤出式生物打印。生物打印中使用的海藻酸盐溶液已经证明了与来自不同组织的许多细胞类型的兼容性，例如骨骼、肌肉、软骨、皮肤、神经和血管，以及包括心脏、肝脏、肾脏和膀胱在内的功能器官。然而，海藻酸盐具有细胞粘附性差的关键缺点。海藻酸盐中缺乏粘附分子或跨膜糖蛋白，会显著降低细胞与海藻酸盐之间的相互作用，从而限制细胞功能。通过添加其他具有细胞粘附能力的生物材料或用特殊的粘附分子序列进行修饰，如可与藻酸盐链共价结合的RGD肽，可以提高藻酸盐的粘附性能。

壳聚糖是甲壳类动物外壳和真菌细胞壁中常见的天然聚合物，由几丁质碱脱乙酰化而成，是由随机分布的n -乙酰-氨基葡萄糖(乙酰化单元)和β-(1-4)-连接的d -氨基葡萄糖(去乙酰化单元)组成的线型多糖。壳聚糖在pKa (pH = 6.5)以下的稀酸性介质中易溶，而几丁质在有机溶剂和常规溶剂中不溶。壳聚糖以其相对便宜、无毒、可生物降解、抗菌和抗真菌的特性而闻名;因此，它已被用于许多医疗应用，从制药到伤口敷料，以及生物打印。由于酸性环境不适合细胞生存，使用典型壳聚糖溶液和活细胞进行生物打印细胞支架具有挑战性。解决这一问题的一种方法是化学修饰壳聚糖的性质，使其可溶于水，溶解后pH值为中性。壳聚糖在生物打印中的应用也经常受到其凝胶速率慢和力学性能差的限制。这些限制可以通过在壳聚糖溶液中加入明胶、淀粉、胶原蛋白、果胶和海藻酸盐等其他水凝胶来缓解，以提高聚合速度和结构强度。壳聚糖具有通过离子化过程与多种化合物形成交联的能力，包括柠檬酸盐和磷酸盐，如三聚磷酸盐(TPP)。与其他聚电解质，特别是聚阴离子，如海藻酸盐或透明质酸，壳聚糖可以有效地交联，因此适合3d生物打印。

琼脂糖是一种天然水溶性多糖，从海藻(红藻)中纯化而来，可以通过温度控制进行自交联和脱交联。通常情况下，琼脂糖溶液可以快速凝胶化，当温度下降到26和30◦C之间，这使得它可以打印，但一些挑战仍然存在。琼脂糖由于其不粘附的性质，对细胞生长的支持有限，并且会随着时间的推移而降解。由于琼脂糖的惰性，它经常被用来形成细胞聚集体和/或支持被包裹细胞的分化。胶原蛋白可以混合到琼脂糖溶液中，以增加对细胞功能的支持，如蛋白质和蛋白聚糖的生物合成，从而允许活细胞的掺入。此外，琼脂糖因其热敏性而被用作支架血管化的“牺牲生物材料”。在这种策略中，琼脂糖纤维以预先定义的模式打印，然后将功能性生物材料和细胞浇铸在纤维上并交联。通过温度控制，琼脂糖纤维可以很容易地融化和去除，留下图案通道。

透明质酸(HA)是存在于细胞外基质(ECM)中最普遍的糖胺聚糖。它分布于整个人体，主要累及结缔组织、上皮组织和神经组织。透明质酸刺激有限的炎症反应，并具有抗原性，使其在临床中广泛用作伤口愈合的真皮填充物，而其润滑特性使其可以用作关节滑液。透明质酸是水溶性的，因此得到的溶液具有高粘度，因此在生物打印中，它经常被用作调节其他生物材料溶液粘度的辅助材料。可调节的物理和生物特性使透明质酸成为一种适合植入细胞的材料。透明质酸可以通过与肼衍生物的共价交联、酯化或退火形成凝胶，但所有这些过程都需要很长时间，并且可能对被包裹的细胞有毒。此外，凝胶化的透明质酸力学性能差，降解速度快。为了解决这些缺点，通常用可紫外光固化的甲基丙烯酸酯(MA)修饰透明质酸，使其成为可光聚合的。HA- ma在保持HA的关键生物学特性的同时获得可控的交联特性，极大地提高了交联效果和支架生物打印应用的机械稳定性。

胶原蛋白是一种丰富的天然蛋白质，由自聚集的多肽链组成，由氢键和共价键连接在一起。它具有天然的细胞附着受体，可直接影响细胞粘附等功能，是应用最广泛的组织支架天然材料。有许多不同类型的胶原蛋白已经被确定;一些胶原蛋白比其他胶原蛋白更适合生物打印应用。在组织工程中应用最广泛的胶原结构包括I型、II型、IV型和V型。其中，I型胶原在生物支架打印中得到了广泛的应用。它可溶于弱酸性水溶液，在37℃和中性pH下可在60分钟内聚合。

因此，可以通过控制pH值和温度来打印胶原蛋白支架。胶原蛋白支架已用于多种细胞类型，包括脂肪、膀胱、血管、骨、软骨、心脏、肝脏、神经和皮肤组织等;然而，它们面临着固有的较差的力学性能的限制。为了使胶原蛋白更适合于支架生物打印和组织工程应用，人们采用了共价键和辐照交联的方法以及胶原溶液的热聚合。此外，将胶原蛋白溶液与海藻酸盐、明胶、透明质酸等其他材料混合也被用于支架生物打印，以改善其力学性能。为了修复许多硬组织，如骨和软骨，通常使用由胶原蛋白和合成聚合物(如聚己内酯(PCL)和聚乳酸-羟基乙酸)(PLGA)制成的支架。首先将合成聚合物按照指定的图案打印成支架框架，为结构和细胞提供机械支撑，然后将胶原蛋白和细胞沉积在框架所创造的空间内，以实现支架的生物功能。

明胶由胶原部分水解得到具有良好的生物相容性、非免疫原性、细胞亲和性和体内完全生物降解性等优点。明胶被广泛用于组织工程应用，因为它具有与胶原蛋白相似的成分。与胶原蛋白类似，明胶对温度敏感，在低温下交联。当温度升高到生理范围或更高时，凝胶脱交联并表现出不稳定性。因此，对于基于挤压的生物打印应用，包括金属离子、戊二醛和其他可打印材料在内的化学物质被用于提高明胶的可打印性和稳定性。利用甲基丙烯酰胺侧基对明胶进行化学改性，合成了光交联明胶水凝胶。合成的甲基丙烯酸明胶复合材料(GelMA)水凝胶已经在紫外线的帮助下成功打印出来，并进一步用于封装各种类型的细胞，用于制造组织工程心脏瓣膜、软骨和血管样结构。改性明胶的机械性能可以通过控制明胶浓度、紫外光强度或曝光时间来调节。

纤维蛋白是机体在凝血过程中自然形成的纤维蛋白，也是天然ECM的组成部分。它含有纤维蛋白原，是一种由两组三多肽链组成的蛋白质:Aα、Bβ和γ链。通过加入凝血酶(一种将纤维蛋白原转化为纤维蛋白的丝氨酸蛋白酶)，纤维蛋白原可以凝胶化形成纤维蛋白水凝胶。凝血因子XIII可以与纤维蛋白聚合物中的γ链共价交联，产生稳定且抗蛋白酶降解的纤维蛋白网络。在生物打印过程中，纤维蛋白可以简单地通过将纤维蛋白原溶液直接沉积到含有凝血酶和因子XIII的混合物中来获得。纤维蛋白是一种多功能生物聚合物，在3d生物制造中具有良好的潜力。基于纤维蛋白的支架具有固有的细胞粘附能力，这鼓励了许多基于将细胞混合到纤维蛋白原溶液中的应用，以构建细胞结合的纤维蛋白结构，从而增强增殖。然而，纤维蛋白支架的使用受到其机械稳定性低和快速降解的限制。改善其机械性能的方法包括在纤维蛋白形成过程中使用高浓度的纤维蛋白原或凝血酶，或将纤维蛋白原与其他提供更好机械稳定性的生物材料混合使用。通过在纤维蛋白原溶液或培养基中添加蛋白酶抑制剂(如抑蛋白蛋白)或优化打印温度、钙离子浓度和细胞密度，可以减缓纤维蛋白原的快速降解速度。由于纤维蛋白原溶液的粘度有限，利用挤出生物打印技术构建基于纤维蛋白的支架具有挑战性。预混合纤维蛋白原和凝血酶溶液已被应用于纤维蛋白基支架制造，以提高打印溶液的粘度。纤维蛋白原溶液与预先确定的纤维蛋白原和凝血酶的比例通常在低温下(约0◦C)制备，以缓和凝胶。其他提高纤维蛋白可打印性的方法包括在溶液制备过程中将纤维蛋白原与其他生物材料混合，然后与相关的交联剂交联用于支架生物打印。

脱细胞细胞外基质(dECM)是一种通过天然组织脱细胞而获得的天然生物材料。脱细胞是一个通过灌注阴离子(如十二烷基硫酸钠)、非离子(如Triton-X100)或其他温和洗涤剂来裂解和去除细胞成分的过程，同时保留组织的ECM。通过这一过程，dECM含有多种具有生物活性的分子和蛋白质，如胶原蛋白、糖胺聚糖(GAGs)、层粘连蛋白、弹性蛋白和纤维连接蛋白，以及促进细胞生长和功能的生长因子，因此，dECM有望通过生物打印用于开发仿生组织和器官。dECM的最新进展使得新的基于dECM的生物材料的合成与各种技术(包括打印)兼容，用于组织工程和各种器官的医学再生，包括心脏、肾脏和肝脏。dECM可以被消化成酸性溶液(如盐酸和乙酸)，然后被NaOH中和。37℃孵育后，由于胶原的存在，dECM是可交联的。值得注意的是，dECM具有较弱的力学性能，这限制了其在硬组织(如骨)工程中的应用。为了解决这个问题，其他聚合物如PCL通常被用作框架来增强结构稳定性。

ECM以及其在生物打印中的加工和应用有待解决的问题。未来的研究迫切需要开发新的方法/技术/策略，以最大限度地减少对dECM的损害，稳定dECM并提高其耐久性，打印dECM以形成具有适当结构和机械/生物性能的支架，并将dECM或支架与适当的细胞类型重新细胞化，包括随后的细胞培养，以形成功能性支架或结构。

肽基水凝胶是通过多肽的合成和自组装成水凝胶或其结构而发展起来的。迄今为止，各种水凝胶结构已经通过非共价力形成，包括氢键、静电和多肽之间的疏水相互作用，或通过化学或酶交联。肽是由氨基酸形成的，根据- conh -酰胺键的数量可以区分为短链或长链肽水凝胶。这些合成的天然材料具有高度的生物活性，能够促进细胞粘附、增殖、迁移和分化，因为它们来源于ECM成分，可用于指导进一步的细胞活动。肽生物链的物理化学性质，包括亲水性/疏水性、凝胶性、释放动力学和机械强度，取决于所结合的肽以及它们在链内的序列。此外，肽基水凝胶的机械性能可以通过改变组装条件来定制，包括肽浓度、电荷、pH和温度等。一般来说，肽基水凝胶可以通过在侧链或末端添加生物功能基序、可降解序列、治疗成分或生长因子来实现功能化。例如，添加基质金属蛋白酶(MMP)和MMP可切割序列，已被用于调整肽的降解特性，因为MMP是能够降解结构ECM组分的天然酶。短链肽(<21个肽键)具有成本效益，与长链肽相比更容易合成;然而，它们往往缺乏机械强度。二肽水凝胶需要在其结构中存在额外的芳香基团，以支持凝胶形成和自组装过程中的机械强度。修饰后的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)二肽的印刷性和机械稳定性得到了改善，方法是将二肽与带相反电荷的末端残基分层，促进静电相互作用，形成稳定的结构，无需额外交联。其他增加3D生物打印机械稳定性的方法包括修改弹性蛋白样多肽使其光敏。为了确定多结构域肽的化学功能如何影响宿主反应，研究人员对多结构域肽进行了进一步研究，发现带负电荷的肽引起的炎症反应最小，且快速重构，而带正电荷的肽引发免疫浸润，促进血管生成和胶原沉积。尽管肽基水凝胶在生物3D打印中应用前景广阔，但仍面临灭菌方法、批间可重复性和大规模生产等技术挑战。

虽然通常与直接细胞掺入不相容，但合成聚合物在基于挤出的生物打印技术中发挥着非常重要的作用，可以增强打印结构的机械性能。虽然生物墨水由于其打印所需的工艺条件(高温、有机溶剂等)一般不能直接由合成聚合物形成，但这些聚合物通常用于或打印形成具有强机械强度的支架框架;然后，结合细胞的水凝胶被生物打印或浸渍到框架的空间中，形成杂交支架。下面概述了3D挤出生物打印技术中常用的合成聚合物。

聚(ε-己内酯)(PCL)是一种可以在生理条件下(如在人体体液中)通过水解降解的聚酯，因此作为一种植入式生物材料引起了相当大的关注。PCL熔点低(60◦C)，疏水，降解缓慢，有利于组织工程中的许多应用(例如，药物输送，抗粘附屏障膜，骨替代)。PCL由于其热塑性性能、可观的机械强度和水解诱导的生物降解特性而被用于3d打印。在液相中，PCL是热稳定的，并且表现出适合印刷的流动行为。当打印到低温打印台上时，PCL可以快速固化并形成机械稳定的3D结构，具有良好的结构保真度。值得注意的是，PCL的熔化温度太高，无法维持细胞活力;因此，打印的PCL支架需要在支架制造、浸渍或用另一种水凝胶生物墨水与细胞打印后进行细胞播种，以形成混合支架结构。一般来说，PCL与其他生物相容性聚合物的结合拓宽了其在组织工程中的应用，包括引导骨再生膜、手术缝合线、给药胶囊等。PCL与聚乙二醇(PEG)偶联导致两亲性热敏行为，这意味着混合物能够通过控制温度进行快速可逆的物理凝胶化。PCL因其易于操作、生物相容性、稳定性以及美国食品和药物管理局(FDA)批准在某些产品中使用而被广泛用于骨组织工程。由于PCL的疏水性和非成骨性，活性生物陶瓷(如羟基磷灰石)的掺入被认为是改善力学性能、细胞附着性和亲水性的有效方法。

聚(乙烯)基聚合物(主要是聚(乙二醇)(PEG)和聚(环氧乙烷)(PEO))是用于组织工程应用的支架生物打印中最广泛使用的合成水凝胶，主要是因为它们具有可定制的特性。它们是由环氧乙烷缩聚而成的，根据分子量可分为PEG或PEO。PEG和PEO能够结合水分子，从而增加腔内水潴留。PEG和PEO可溶于水，其代谢惰性和生物相容性降低了植入后的免疫原性。溶液可以通过物理、离子或共价键方法交联成水凝胶。PEG和PEO水凝胶具有高渗透性，促进营养物质和废物的交换，支持细胞代谢;因此，它们经常被用来包封细胞以供细胞递送。

然而，由于它们的合成性质，这些水凝胶对蛋白质结合和细胞粘附的支持有限。为了克服这一限制，PEG/PEO水凝胶通常用多肽修饰，如RGD肽，它们具有增强细胞粘附的能力。对于支架生物打印，PEG/PEO溶液通常使用丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯进行光聚合。

这些改性溶液可以通过紫外线有效地交联，以提高挤出后的机械稳定性。

Pluronic®是一种基于聚环氧乙烷(PEO)和疏水性聚环氧丙烷(PPO)的三嵌段共聚物，排列成AB-A三嵌段结构(PEO-PPO-PEO)。它是热敏性的，因为PPO侧链在22至37℃(取决于聚合物浓度)之间的阈值温度以上变得不太可溶，并且发生凝胶化。Pluronics具有表面活性剂特性，由于其两亲性(存在疏水和亲水成分)，使其能够与疏水表面和生物膜相互作用。然而，由于其合成性质，Pluronic的缺点包括有限的细胞粘附和降解。先前的研究也表明，它在培养一周后显著溶解，由于可能破坏细胞膜，因此具有可疑的细胞相容性。Pluronic可以用作牺牲生物墨水，用于制作3D生物打印的模具、通道、血管或血管系统，也可以用作临时支撑结构[116]。尽管如此，Pluronic的优点，如高粘度和良好的可打印性，仍然使其对具有良好形状保真度的生物打印结构具有吸引力。

复合生物材料的使用允许协同特性和性能。天然聚合物的生物相容性和合成聚合物的机械性能使这两类聚合物成为组织工程的理想材料。然而，单一材料的机械/生物性能往往是有限的，这就增加了对复合材料的需求。此外，单一材料的性能可能并不总是容易控制或一致，从而降低了其在某些应用中的适用性。一般来说，有两种类型的水凝胶复合材料:1)两种或两种以上的水凝胶形成聚合物和2)填充增强或增强性能的聚合物。

形成水凝胶的聚合物可以与两种或多种具有协同性能的天然和/或合成聚合物结合。复合水凝胶是由I型胶原蛋白和ECM蛋白合成的，与单独从一种材料获得的凝胶相比，它们具有更好的机械和生物性能;也可以从海藻酸盐和I型胶原蛋白中提取，具有改善的流变学和压痕特性。在生物打印的背景下，从dECM/海藻酸盐、海藻酸盐-透明质酸、海藻酸盐二醛-明胶、壳聚糖-海藻酸盐-羟基磷灰石、海藻酸盐-羧甲基壳聚糖[46]和海藻酸盐-明胶等合成了许多复合材料。

对于带填料的复合水凝胶，最广泛使用的填料是无机类陶瓷羟基磷灰石和石墨烯等碳基材料。受生物系统中天然存在的生物活性纳米材料的启发，研究人员正在开发新型生物活性生物材料，将无机陶瓷与天然或合成聚合物相结合，以增强机械/生物性能，以及在生物打印背景下的可打印性。广泛的生物活性陶瓷纳米颗粒，包括羟基磷灰石、硅酸盐纳米颗粒和磷酸钙，已被用于合成复合水凝胶。碳基材料也可以用于增强生物医学工程应用中的导电性，以及生物打印或工程支架的性能和功能。事实上，许多带有填充物的复合材料已经被开发用于生物打印，具有更好的打印性、电活性和生物相容性

对于生物打印，生物材料或聚合物以凝胶，粉末和/或颗粒的形式可用，并且必须使用水或其他溶剂以溶液形式制备。聚合物要么是水溶性的，要么是非水溶性的。水溶性材料可直接溶于水或水基溶液中。广泛用于打印的生物材料，如海藻酸盐和明胶，都是水溶性材料，可能需要几分钟到几小时才能溶解。许多材料在中性pH和室温条件下溶于水，但在非中性pH或高温条件下很容易溶解。壳聚糖、胶原蛋白和聚乙烯醇(PVA)等材料也被归类为水溶性材料。非水溶性生物材料在用于支架制造的挤压生物打印中必须在应用前处理成溶液样阶段。为了实现这一点，这些不溶性材料要么溶解在特殊的有机溶剂中(例如，用于聚己内酯(PCL)的氯仿)，要么在材料挤压过程中通过控制温度进行热熔化。

表1常见的生物材料及其溶液制备/凝胶化方法，以及它们的优缺点和应用

为了制造模拟天然组织/器官的结构，可能需要用活细胞制备生物材料溶液(形成生物墨水)进行生物打印。因此，制备的溶液必须提供既有利于细胞存活又适合打印的水环境。目前，用于细胞生物打印的最广泛的生物材料是聚合物或凝胶化聚合物或水凝胶，它们可以提供一个温和的环境，以保证混合细胞在溶液中的活力，而固化后形成的水凝胶含有大量的水，具有与天然组织相似的性质。

天然水凝胶由于其固有的生物相容性而广受欢迎，而合成水凝胶具有更均匀和可预测的性质。最常用的水凝胶包括海藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸(HA)、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、聚乙二醇(PEG)和聚环氧乙烷(PEO)。脱细胞基质(dECM)成分也被开发成生物材料，用于细胞支架生物打印(表1)。

值得注意的是，利用天然水凝胶构建结构时面临的一个主要挑战是其有限的机械性能。为了解决这一挑战，一些具有高机械强度的非水溶性聚合物经常被用于挤出生物打印，与水凝胶结合来开发混合支架。这些材料通常在打印过程中通过温度控制溶解在溶剂中或在生物打印机内融化，然后逐层挤压形成支架框架。由于所使用的溶剂或高温环境可能导致细胞和组织存活方面的严重问题，细胞不能添加或混合在这些材料中。这类材料在挤出生物打印中应用最广泛的是聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物。

在挤压生物打印过程中，生物墨水被加载到打印机墨盒中，然后在适当的交联反应或机制的帮助下挤压形成3D结构。构建物的成功生物打印及其在后续应用中的成功使用依赖于配方生物墨水的特性，包括物理、流变、交联、机械和生物特性。

生物墨水的表面张力和润湿性是挤压生物打印的重要物理参数。

生物墨水的表面张力是施加在生物墨水表面单位长度轮廓上的内力，它在打印后生物墨水细丝的形成中起着关键作用。一方面，在打印过程中，较大的表面张力导致液滴形成或附着在喷嘴尖端;另一方面，一旦沉积在平台上，大的表面张力可以帮助保持长丝的形状或轮廓。

生物墨水的润湿性是指与固体表面(包括喷嘴和打印床)保持接触(以一定的接触角)的能力。它是影响生物油墨在印刷阶段沉积的第一层的重要参数

图3 生物打印过程中形成的第一层

图三表示出具有不同接触角形成的两条股线(印刷股线轮廓与印刷阶段之间的角度)。大的接触角有助于保持打印水凝胶结构在垂直尺寸上的保真度，而小的接触角有助于将打印结构固定在打印阶段，避免在逐层打印过程中不希望的运动和可能的变形，从而有助于保持结构的完整性

生物墨水的流变或流动行为，与其流动阻力相关，通常由生物墨水内的剪切应力和剪切速率之间的关系来表征，其中剪切应力与剪切速率的比值被称为表观粘度或简称粘度。生物链的流动行为可以通过生物材料浓度、细胞密度、温度以及生物链或生物材料溶液的合成方法来调节。

图4 海藻酸盐基生物墨水的流动行为随海藻酸盐浓度(a)、细胞密度(b)和温度(c)的变化

图4所示为海藻酸盐基生物链的实验结果示例。

为了描述生物材料溶液的流动特性，有各种各样的模型可用于此目的。常用的模型有幂律模型、广义幂律模型、Carreau流体模型、Ellis流体模型、Casson流体模型;其中，广义幂律方程(又称三参数Herschel-Bulkley模型)在文献中得到了广泛的应用，其公式为

其中t和t0分别为剪切应力和屈服应力;当t < 0时，流体表现为固体性质，当t > 0时，流体表现为剪切变薄，当n > 1时，流体表现为剪切变厚。γ˙为剪切速率;K为一致性指标，单位为Pa × s的n次方;n为流动性能指标(无量纲)。对于牛顿行为，t0 = 0, n = 1。在物理上，K是粘度的度量(即，粘度越高的流体K值越高)，n是非牛顿行为程度的度量(即，当n偏离单位时，非牛顿行为变得更加明显)。对于给定的流体，n、0和K的值是由测量的流动特性确定的。通常，n被确定为常数，而t0和K是浓度和温度的函数，以考虑它们对流动行为的影响。为了实验测量和表征生物材料溶液或生物墨水的流动行为，常用的技术和/或设备，包括毛细管流变仪、锥板流变仪、平行板流变仪和振荡流变仪。

生物墨水的流动行为可以显著影响生物打印过程。一方面，更高的粘度可以增强可打印性，因为粘性更高的生物墨水一旦打印出来，就更难以流动和扩散，从而有助于保持打印的长丝和3D结构。此外，具有足够粘度的生物墨水可以使被包裹的细胞保持在原位，并可以防止细胞分布不均匀或沉积。另一方面，更高的粘度需要更大的压力进行生物打印，增加过程中对细胞的诱导力，从而降低细胞活力。由于在打印过程中，随着剪切速率的增加，生物墨水的粘性会降低，因此在生物打印中通常需要剪切变薄的行为(粘度随着流速的降低而降低)。由于剪切应力在离开打印针或喷嘴后被消除，生物墨水的粘度迅速恢复，从而导致高丝保真度。为了表征生物墨水的剪切减薄特性，上述广义幂律模型已被广泛使用，其中剪切减薄行为用小于1的幂律指数表示(值越小，剪切减薄行为越明显)。

生物打印过程中的一个重要步骤是从生物材料溶液或生物链接到凝胶或交联水凝胶的过渡。通过交联过程，聚合物链通过物理方法和/或化学反应连接在一起，从而产生具有结构稳定的聚合物网络的水凝胶。虽然有多种方法可供使用，但生物打印中常用的方法主要包括离子、热、光和酶交联。

离子交联发生在水溶性带电荷的聚合物与带相反电荷的离子交联时。例如，藻酸盐是一种众所周知的聚合物，它可以被Ca2+、Ba2+和Zn2+等二价金属离子交联。离子交联是生物打印中一个重要的机制，因为它提供了温和和即时凝胶化的聚合物溶液。它的缺点包括机械强度有限，以及植入后金属离子释放到体内。对于离子交联，通常使用水溶性钙盐如氯化钙(CaCl2)、硫酸钙(CaSO4)和碳酸钙(CaCO3)进行交联。添加Ca2+离子(或其他二/三价阳离子)引起溶液的快速凝胶化。

由于这种交联在生理条件下瞬间发生，离子交联水凝胶已广泛应用于组织工程应用的生物打印。

热交联发生在对温度敏感的聚合物中，其中增加或降低温度可导致交联或凝胶。通过热交联形成水凝胶的聚合物，如琼脂糖、明胶和胶原蛋白，具有凝胶转变温度，低于该温度，溶液就会凝胶化。通常，由热交联形成的凝胶机械性质较弱。

光交联是指光诱导大分子之间形成共价键，形成交联网络。如果用激光或可见光照射，光固化聚合物可以被打印成3D水凝胶。其他一些聚合物，如含有酪氨酸残基的蛋白类生物聚合物(如胶原蛋白、纤维蛋白和明胶)，只有在加入适当的光引发剂时才能进行光交联。虽然许多聚合物不能通过光直接交联，但与丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯类试剂的化学反应使它们具有光交联性。这些聚合物通常通过紫外线交联，通常波长在320-365纳米范围内。值得注意的是，使用紫外光有潜在的生物风险，因为紫外光可能会损坏打印结构中的细胞，也可能对操作人员有害。

光交联聚合物生物打印已被报道使用明胶-甲基丙烯酸酯、透明质酸-甲基丙烯酸酯和右旋甲基丙烯酸酯。

酶交联利用酶作为催化剂在蛋白质基聚合物之间形成共价键。由于保持细胞活力的酶促反应温和，该方法有望用于生物打印。在生物打印中，已经使用了几种酶，包括微生物转谷氨酰胺酶、酪氨酸酶(Ty)和辣根过氧化物酶(HRP)。酶交联通常用于从透明质酸、明胶、纤维蛋白原、多肽(PLys-b-(PHIS-co-PBLG)-PLys-b-(PHIS-co-PBIG)-b- plys)和壳聚糖形成水凝胶。酶交联的局限性包括难以获得酶，所产生的水凝胶的机械性能有限，以及在培养基或支架中的活性较低。此外，酶催化的交联可能对温度和pH等环境条件敏感，从而影响和降低交联或生物打印过程。

生物材料或生物连接水凝胶的力学性能在组织工程中具有重要的应用价值。由生物材料或生物墨水打印的构建体通常在生物反应器(体外)中孵育成熟，随后植入活体(体内)，在那里它们为细胞提供3D结构和机械支持，以支持细胞过程，如迁移、增殖和/或分化，从而产生功能性组织工程构建体或活组织。生物墨水或印刷结构物的机械性能以其机械强度和降解性为特征。因此，结构体的机械性能是动态的，由于组织再生而导致的机械强度增加与降解引起的生物材料强度下降相对抗。最终，在整个再生过程中，构建的机械性能应该与被修复的组织/器官相似。人们普遍认为，在植入初期或在愈合过程中，支架生物材料与再生组织联合构建的机械性能应与被修复的组织/器官相似。

在许多组织工程应用中，弹性和刚度是重要的力学性能。这些机械性能的典型特征是施加的力和产生的变形之间的关系。为了进行表征，在机械测试期间通常应用于样品的加载条件是拉伸/压缩力，弯矩和扭矩;用这些力引起的变形测量得到应力-应变曲线。从这些曲线中，弹性模量和屈服应力通常由生物打印材料和/或结构表征。加载条件的选择取决于被修复组织/器官的预期应用或生物力学条件，以及所使用的生物材料或水凝胶。例如，压缩试验常用于骨/软骨组织工程，而拉伸试验常用于肌腱/肺/心脏组织工程。

加载条件的选择，表2概述了组织工程应用中常用水凝胶的测试方法和机械性能。

表2 各种水凝胶的力学性能及表征方法

考虑到许多柔软或坚硬的组织，如神经、皮肤、肺、骨骼和肌腱，表现出复杂的时间和速率依赖的力学性能，最近的研究也开始关注组织工程应用的粘弹性表征。具有流体和弹性特性的材料或生物链接水凝胶在变形时可能同时表现出粘性和弹性特性。

为此，粘弹性通常用储存模量和损失模量来表征。存储模量表示粘弹性材料以弹性方式存储能量的能力，而损失模量表示在材料的粘性组分中耗散的能量。值得注意的是，对于给定的材料或溶液，存储模量和损耗模量，如振荡流变仪所表征的，通常不是恒定的，而是取决于所施加的正弦染色的频率和幅度。在这种情况下，进行频率扫描试验(例如，恒定应变下从0.01到100 Hz)和应变扫描试验(例如，恒定频率为1 Hz下从0.01到100%)来测量和表征存储模量和损耗模量，以及损耗角(或应力与应变之间的相位角)，如图5所示。

图5 测量不同浓度海藻酸双醛(ADA) -明胶(凝胶)水凝胶的储存模量和损失模量以及损失角(或ADA:凝胶的比例为6:2,3:2,2:2,2:3,2:6和3.75:3.75)

黏弹性生物材料的力学性能也可以通过蠕变和松弛试验来量化。蠕变试验是为了分析材料在恒定载荷或应力下的行为，而应力松弛试验是在恒定变形或应变下进行的。

生物打印材料的生物学特性通常以其生物相容性、生物降解性和免疫原性为特征。

生物相容性是指支持细胞生长/功能的能力，如细胞存活、附着、增殖、分化和组织再生。在生物打印过程中，活细胞与水凝胶形成的聚合物溶液混合，形成生物墨水，然后进行生物打印过程。在生物打印过程中，细胞暴露于过程诱导的恶劣条件下，如剪切应力和/或高温，这可能导致细胞损伤。因此，生物墨水中只有部分细胞在生物打印过程中存活下来。细胞存活率是指打印后活细胞占细胞总数的百分比。细胞活力测定用于测量和确定样品中健康细胞的比例，并采用各种测定方法来检查打印构建体中的细胞活力。为了区分受损细胞和正常细胞，偶氮染料台盼蓝或荧光染料钙黄蛋白- am和碘化丙啶等染料被广泛使用，因为它们能够选择性地染色活细胞和死细胞或受损细胞。值得注意的是，挤压生物打印的细胞活力差异很大，这取决于细胞类型。生物墨水打印后，形成的结构在支持细胞活力以及通过细胞附着、增殖、分化和/或组织再生等其他细胞功能方面发挥重要作用。

生物降解性：用于打印或生物打印的材料应可降解为水溶性、无毒、可被肝脏代谢和/或通过肾脏排泄的单体。此外，获得的降解机制和副产物不应引起对再生组织和/或周围组织造成损害的有害变化。生物打印中形成的水凝胶可以在水环境中通过水诱导的某些键/链的切割(或水解)和/或在特定酶的存在下通过酶诱导的切割来降解。水解的生物降解通常通过体积和/或表面降解机制发生，而在酶降解中，水凝胶中的键/链裂解是在非生物条件下由酶的催化作用引起的，其速率取决于裂解位点的数量和酶的浓度。对于给定的水凝胶，降解率可能受到几个因素的影响或调节。细胞/聚合物比是其中之一，细胞是基质重塑蛋白酶的来源，相对较低的细胞密度或较高的聚合物浓度会降低降解速率，从而延长降解时间;然而，降低细胞密度也会导致组织再生不良。调节水凝胶降解时间的另一种方法是控制聚合物网络内的交联度。增加聚合物浓度、交联剂浓度和交联剂的暴露时间是实现更高交联从而降低降解率的方法。研究人员还用对酶降解敏感的肽修饰了水凝胶形成聚合物，以实现对水凝胶降解行为的控制。水凝胶的降解行为主要是通过计算相对于初始条件的重量变化来确定的。

生物材料或生物链接的免疫原性是指其在体内植入后引起免疫反应的能力。打印结构中的生物材料和细胞都是潜在的抗原来源，可能导致先天免疫系统反应形成纤维化胶囊以隔离植入材料，或者获得性免疫系统反应引起抗原特异性反应。由于存在抗原，天然来源的生物材料易受获得性免疫的影响，而合成的生物材料通常易受先天免疫的影响。生物材料的免疫原性很重要，因为强烈的免疫反应会导致支架降解时间缩短，对嵌入细胞的潜在攻击，以及纤维化而不是组织再生的可能性更高。

挤出生物打印系统被配置为沉积或打印连续的生物墨水链或纤维，以形成逐层的3D结构。基于挤压的生物打印系统通常类似于图6所示的配置示意图，它由打印头、三轴定位系统和打印阶段组成，全部由计算机控制。

图6 典型的基于挤压的生物打印系统示意图

定位系统用于在打印台的X，Y，Z方向上移动打印头，而打印头则将装载在注射器中的生物墨水沉积到打印阶段。温度控制用于调节生物墨水和打印阶段的温度，通常在10到200℃的范围内。装载在注射器中的生物墨水通过针头驱动，针头通常具有圆柱形或锥形，直径范围从0.1 mm(或100 μm)到2mm。印刷线的直径和分辨率很大程度上取决于针的直径，用更小的针可以获得更高的分辨率。对于生物打印结构来说，生物材料的流速、设计和形成的相应结构、过程诱导的力以及生物材料溶液的交联都是至关重要的。

在生物打印过程中，通过逐层堆叠打印链，生物墨水被打印成具有3D结构的结构，因此，打印链的特性影响打印支架的结构。打印链的大小与打印的生物墨水的流速成正比，即单位时间内从针头中挤出的生物墨水的体积(或质量)。流速可能受到工艺参数(如打印力和温度)、结构参数(如针头几何形状和尺寸)和生物墨水流动行为等因素的影响。表示生物打印中流速的一种方法是从实验数据中开发经验模型，但这通常需要详尽且耗时的实验。一种更有效地表示被打印生物墨水流速的方法是基于物理定律，由此产生的分析模型为严格调节生物打印过程中的流速奠定了基础。

对于气动驱动的生物打印，使用加压空气来推动生物墨水通过注射器的针头。对于流变行为可以用广义幂定律描述的生物墨水或生物材料溶液，即方程式（1），其流量由以下公式给出。

上述方程表明，生物墨水的流速取决于其流动特性(通过τ0、K和n)，可以通过改变打印工艺参数(通过ΔP)来调节，并受针头结构参数(通过R和L)的影响。如果生物墨水的流动特性和参数值已知，则可以计算出生物墨水在打印过程中的流速。这些方程还提供了一种方法来确定给定针头所需的打印压力，以达到支架制造所需的流速。在气动驱动的生物打印中，针头的几何形状是影响生物墨水流速的另一个因素;在相同的印刷压力下，锥形针的流速要远远高于圆柱针的流速。生物打印中的可挤压性与流速有关，是指通过针头挤压或打印生物墨水以形成连续可控的细丝的能力。

与气动驱动系统相比，螺杆驱动和活塞驱动系统都可以更直接地控制生物链的流速。研究表明，螺杆驱动系统的流量包含两个组成部分。一个分量是由于螺杆旋转引起的阻力流量，与螺杆转速成正比;另一个分量是压力驱动流量的速率，与压降成正比。因此，在螺杆驱动的生物打印中，生物墨水的流速受到螺杆速度和/或施加在生物墨水储存器上的打印压力以及螺杆的几何形状和流动行为的影响和/或调节。在活塞驱动系统中，在假定生物墨水不可压缩的情况下，生物墨水的流速只取决于活塞的运动，而与被打印生物墨水的特性无关。因此，与气动和螺旋驱动的生物打印相比，活塞驱动的生物打印可以提供对流量的最佳控制。

在生物打印过程中，生物墨水在打印阶段沉积或打印。然而，生物墨水，一旦打印在舞台上，仍然是溶液或半溶液形式。由于重力的作用，生物链可以流动或扩散，从而在链的交叉处混合或融合，或者在上链跨越下链之间的间隙或在其末端悬垂时变形。因此，钢绞线轮廓和支架结构与设计时有所不同，如图7所示，其中顶视图(a)显示了钢绞线在不同位置的截面变化，横断面视图(b)显示了钢绞线在垂直方向上的挠度和孔径，以及整个结构高度的降低。

图7 设计和打印脚手架结构之间的线轮廓差异:(a)俯视图和(b)横断面视图

在生物打印支架的过程中，生物墨水从针头中挤出，并根据支架的设计控制其在水平面上的移动。针在水平面上移动的速度对于在印刷阶段形成的线的横截面尺寸或轮廓是重要的。如果不考虑流出针头的生物链的膨胀，生物链一旦被挤出，就会形成一个直径为D的圆柱形长丝，其大小由挤出喷嘴的生物链的流速Q和喷嘴的运动速度V决定，即

由上式可知，在给定流速下，股径由针速决定。请注意，如果忽略材料的膨胀，使用特定的针速将确保打印股的直径等于生物打印针的内径;这样的速度被称为无应力(SF)速度，因为在链内没有应力诱导。如果选择的针速比顺线速度快，打印的股线会拉伸，在股线内部产生拉应力，导致股线直径小于针;反之亦然。

图8 针速对印刷架的影响，

其中顺位速度约为40毫米/秒

图8显示了打印股对针速的依赖关系，其中顺流速度约为40 mm/ s。如果选择的针速太高，由于机架内产生的拉伸应力，可能无法保持股线的连续性，导致股线断裂。另一方面，当针速低于SF速度时，会引起股内的压应力，导致林分方向不规则，股径增大。如果针速过低，由于诱导的压缩，打印直股变得困难。

在生物打印过程中，细胞受到持续的过程诱导的力，如压力、剪切应力和拉伸应力，这些力会导致细胞膜变形和破裂。

图9 生物打印过程中细胞所承受的机械力

(a)静水压力;(b)剪切应力(为简单起见，取

屈服应力τ 0 = 0);(c)拉应力 

虽然细胞有弹性能力抵抗一定程度的机械力，但如果施加的力超过一定的阈值，细胞膜可能会失去完整性;因此，细胞可能受损，甚至失去功能和活力。当细胞悬浮在溶液中时，静水压力会对细胞产生压缩力(图9a)。在生物打印过程中，压缩空气对加载在注射器中的细胞悬浮液产生作用力，相应的静水压力近似等于生物打印压力(如果可以忽略注射器中的压降)。

针内也存在静水压力，其大小取决于针内细胞的位置。

其中ΔP为沿针头的压降，Ln为针头长度，l为针头入口到针头内细胞位置的距离(0 < l < Ln)。

剪切应力是一种在生物打印过程中引起细胞损伤的机械力。由于注射器的直径远大于针尖直径，因此可以忽略注射器内部的生物墨水流动，因此当细胞悬浮液被迫流过时，生物打印过程引起的剪切应力主要分布在狭窄的针尖内部(图9b)。其中，为了简单起见，我们认为屈服应力为零，因此不涉及速度的塞流区域)，并由以下公式给出

其中r是从尖端中心到测量剪切应力的位置的径向距离(0≤r≤R，其中r为针半径)。

由上式可知，针尖处的剪应力与压降和针长有关，考虑到流动充分、针壁无滑移，针内剪应力沿径向呈线性分布。在给定压力和针长下，剪切应力在针壁处达到最大值，在针心处减小为零。

细胞承受的另一种机械力是拉伸应力，这是由拉伸流场产生的拉伸应力。在针突收缩区域产生拉伸流动，收缩区域前后溶液速度差较大(图9c)。有几种方法可以表示收缩区的拉伸应力，例如通过测量拉伸速度或检测收缩区的压降。检测压降是一种更容易的方法，它假设锥形入口的压降是由剪切流动和拉伸流动引起的，并且这些项是相加的。基于这一假设，流体将采用收缩剖面来最小化总压降，流体的拉伸粘度与拉伸速率无关，而剪切粘度是剪切速率的幂律函数。因此，拉伸应力的表达式为

其中τe为拉伸应力，Pen为收缩区压降，n为剪切流的幂律指数。此表达式仅适用于入口区域的入口角足够大，不干扰流型的情况。这只能保证大的角度，接近一个突然或平坦的入口角度为90◦。此外，得到的拉应力是一个平均值，不能反映该地区不同流线的流动特征。

需要指出的是，由于生物打印的复杂性，很难，甚至不可能表示过程诱导的力，从而导致细胞损伤。如今，机器学习开始用于预测细胞活力和优化打印参数以提高细胞活力。预计机器学习在实时监测和/或反馈的帮助下，将允许调整打印参数，如打印速度、压力和温度，以保持细胞活力或最大限度地减少细胞损伤。

为了制造具有一体化结构的基于水凝胶的3D支架，必须对水凝胶溶液进行固化或交联以增强其机械强度和稳定性。交联可以通过物理刺激引起，也可以通过交联剂或酶促反应引起。在这些方法中，最常用于生物打印的是离子、热和光交联。根据水凝胶的性质，各种具有相关构型的交联方法已经被开发用于生物打印，如图10所示

图10 水凝胶支架交联的方法和结构。(a)温度控制下的交联;(b)喷雾下交联;(c)中液交联;

(d) pre-crosslinking;(e)紫外光下交联

以及表3所列的优点和缺点。

表3 生物打印中的交联技术

通过控制热敏生物墨水的温度，如琼脂糖、明胶或胶原蛋白，在打印前后，生物墨水的热交联可以在生物打印过程中发生。图10a显示了一种结构，其中将注射器中的生物墨水温度控制在生物墨水的熔化温度之上以保持其溶液形式，并将打印阶段的温度设置为低于凝胶温度，以便生物墨水一旦打印，就会在台上凝胶化。因此，交联过程需要在生物打印系统中安装一个温度调节控制器。

离子交联是可逆的，已广泛应用于海藻酸盐、壳聚糖等水凝胶。聚合物分子遇到交联剂后形成离子键，发生凝胶作用。化学交联类似于离子交联，水凝胶溶液和交联剂必须接触。水凝胶的形成是由交联剂触发的，交联剂通过共价化学键连接水凝胶分子。引入交联剂的一种方法是将其雾化，然后将其喷射到挤出的水凝胶溶液上(图10b)。 与该方法相关的挑战包括控制雾化剂以允许在挤出溶液上均匀分布以形成直径均匀的链，以及由于雾化交联剂的有效性有限而导致的相对缓慢的凝胶化和不完全交联。

因此，保持结构的保真度和稳定性变得困难，特别是当使用低粘度等机械性能差的水凝胶前体时。为了解决这些问题，可以将水凝胶溶液沉积到含有交联介质的浴槽中(图10c)。由于在熔槽中均匀地提供了足够的交联剂，与交联剂接触的沉积溶液的表面迅速固化，限制了水凝胶溶液的扩散，从而支持印刷链的保真度。这种方法也被称为3D生物绘图，需要仔细调整交联剂，因为如果使用不合适的交联溶液，交联介质的浮力可能导致支架堆叠失败。高浓度交联剂导致的凝胶化速率过高，会导致链链表面快速硬化，从而降低相邻层之间的连接，导致支架稳定性差。另一方面，交联剂浓度低导致凝胶化速度慢，会导致打印链由于溶液扩散而保真度差，机械性能差，甚至无法支撑打印结构。预交联，通过在水凝胶溶液中加入低浓度的交联剂并混合，也可以用于基于水凝胶的生物打印(图10d)。预交联方法在水凝胶溶液中引入了水凝胶颗粒，从而增加了水凝胶溶液的粘度，从而提高了沉积质量。打印支架的结构稳定性可以很容易地通过将打印支架暴露在高浓度的交联剂溶液中来实现。预交联支架的力学性能良好，但生物打印过程中所需的打印压力相对于预交联水凝胶的粘度而增加。此外，预交联会导致水凝胶溶液中水凝胶颗粒分布不均匀，导致挤出过程中的不连续和不均匀性。UV光束可用于生物打印以引发水凝胶光聚合(图10e)。水凝胶在光引发剂的存在下可在光照下发生光聚合。当使用光源时，光源与光敏化合物(光引发剂)的相互作用引发聚合。例如，明胶是一种廉价的变性胶原蛋白，保留了丰富的整合素结合基序和促进细胞粘附的基质金属蛋白酶敏感基团。通过将甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酰胺基团添加到含胺的侧基上，明胶就变成了明胶甲基丙烯酰(GelMA)，一种可光聚合的材料。GelMA保持了明胶的热敏特性，可以在温度控制下凝胶化，但也可以在紫外线照射下永久聚合。因此，基于挤压的生物打印与UV光源相结合可用于生产基于gelma的支架。

可打印性是生物挤出打印的关键问题之一。值得注意的是，在生物打印过程中，生物油墨一旦打印出来，仍然是溶液或半溶液形式，可以在打印床上流动或扩散;因此，打印的结构可能会与其设计不同(图7);这种差异的程度被用来表征生物打印性能的一个角度，称为可打印性。量化可印刷性的标准化方法尚未确定;然而，常见的方法结合了可挤出性，细丝保真度和结构完整性方面的可打印性检查。可挤压性是指在适当的打印条件或参数下，生物墨水通过针头以可控的方式挤压形成连续长丝的能力(图8)。这通常是通过测试各种打印参数的组合来确定的，包括针径、打印速度和压力，然后分析打印股的尺寸和一致性。线材保真度是指在印刷阶段形成的线材截面与印刷针截面的差值。如图7所示，所形成的长丝的横截面可能会因层和位置的不同而发生显著变化，从而导致长丝具有最大和最小直径以及不同的高度。这两个维度之间的差异提供了基于线材保真度的可打印性的定量测量。结构完整性定义了在打印后保持与设计尺寸相似的3D结构的能力。结构的完整性会降低，因为打印的长丝在链交叉处融合，或者由于悬挂在下面相邻的层上而变形，这导致在每一层的厚度、整个结构的高度和/或各个方向的孔径方面与设计的结构不同。

可印刷性受到许多因素的影响，包括配方生物油墨的特性和所选印刷参数的参数。表面张力和润湿性是影响印刷性的另外两个重要物理参数，因为它们影响第一层的形成，如图3所示。值得注意的是，大多数由玻璃或塑料组成的印刷阶段与印刷的水凝胶有很大的接触角，因此，在印刷结构和印刷表面之间建立锚点是困难的。这个问题可以通过在疏水高密度介质(如全氟三丁胺)中印刷水凝胶来克服，以减少印刷时的接触角，或者在印刷表面涂上一层薄薄的化学物质，如3-(三甲氧基硅基)甲基丙烯酸丙酯或聚乙烯亚胺，以改变印刷表面的特性，以减少接触角。

值得注意的是，尽管生物油墨的表面张力和接触角在流体轮廓的形成中被认为是重要的，但它们对可印刷性的影响尚未得到研究和阐明。研究表明，生物墨水的流变行为对其可印刷性有显著影响。一方面，黏度越高的生物墨水溶液，印刷适性越好，因为高黏度往往会减少生物墨水的流动/扩散。另一方面，被封装的细胞在粘性较低的生物墨水溶液中存活得更好，而粘性较低的生物墨水需要相对较小的机械力来进行生物打印，从而减少了过程诱导的力并保持了细胞的活力。此外，生物链黏度随剪切速率变化，称为剪切变薄/触变行为。在生物打印中，通常需要剪切变薄行为，因为在打印过程中，随着剪切速率的增加，具有剪切变薄行为的生物墨水的粘性会降低。由于剪切应力在离开喷嘴后被消除，生物墨水的粘度迅速恢复，从而导致高丝保真度。研究还表明，所使用的交联机制和交联后生物链的机械性能对细胞活力和可打印性都有显著影响。快速交联的生物油墨是理想的最佳印刷适性;因此，生物墨水在打印时立即交联是维持打印结构的常用方法。交联不充分或机械薄弱的水凝胶结构将发生结构变化并可能崩溃。在生物打印的背景下，已知生物墨水(或tanδ)的损失角度直接影响可打印性。

细胞活力是挤压生物打印的另一个关键问题。在生物打印过程中，细胞受到持续的过程诱导的力，如压力、剪切应力和拉伸应力，这些力会导致细胞膜变形和破裂。虽然细胞有弹性能力抵抗一定程度的机械力，但如果施加的力超过一定的阈值，细胞膜可能会失去完整性;因此，细胞可能受损，甚至失去功能和活力。

如前所述，特定应用的最佳生物墨水必须支持细胞粘附、迁移、和增殖，直接和/或控制细胞分化，表现出有限的免疫原性，并具有与被模拟组织相似的机械特性，同时以与细胞向内生长和ECM沉积相容的速率降解。所有这些特性还必须与生物链接的可打印性相平衡，以允许形成具有可重复设计的高分辨率结构，支持营养和废物运输。因此，生物链的发展、细胞整合、血管化和打印分辨率都是高度相互关联的;挤出生物打印领域仍有许多问题或挑战有待解决。

生物墨水的目标是尽可能地模拟天然组织，以支持组织功能;然而，天然组织是由各种成分组成的复杂网络，包括生物活性蛋白和分子(胶原蛋白、gag、层粘连蛋白等)和生长因子。虽然使用复合聚合物在开发具有与天然组织相当的机械性能的生物墨水中是司空见惯的，但这些生物墨水仍然缺乏天然组织中发现的许多生物活性分子。

虽然研究人员一直在开发具有多种成分的更复杂的生物墨水，但这通常受到单个成分的费用以及保持可打印性的需要的限制。

添加dECM，它包含这种复杂的生物活性成分网络，是一种有前途的策略，以增加开发油墨的生物复杂性;然而，使用dECM有其自身的挑战。在许多形式下，dECM缺乏可打印性，虽然去除所有细胞和遗传物质是脱细胞的主要目标之一，但平衡这种完全去除同时限制对ECM基质的损害是困难的。Klak等人最近开发了胰腺dECM/明胶甲基丙烯酸酯生物链接，并在3D挤出打印胰岛之前测试了其机械性能、热稳定性和细胞毒性。然后将打印的支架植入小鼠体内并分析其功能。研究发现，含有生物链接的dECM在胰岛素分泌方面的功能是不含dECM的材料的三倍。随着在临床应用中使用挤压生物打印的可能性的增加，一些生物材料和细胞培养条件也引起了伦理和安全问题。

例如，在组织工程领域广泛使用的Matrigel来源于小鼠肿瘤的基底膜。因此，临床翻译存在广泛的批次差异和安全性问题。在细胞培养中使用胎牛血清(FCS)也引起了类似的安全和伦理问题。尽管FCS通常允许各种细胞类型在较长时间内维持和活跃生长，但在屠宰场从未出生的小牛中采购FCS已经引起了伦理问题，以及由于批次之间的差异而缺乏可重复性的安全问题。

一旦一种合适的生物材料被开发出来，研究人员就面临着细胞选择的挑战。由于将大量细胞并入生物墨水通常需要大量细胞，因此通常使用细胞系，因为它们相对便宜且易于获得;然而，细胞系通常缺乏功能。为了克服这一点，许多研究人员已经转向使用原代细胞或干细胞。在这些情况下，研究人员依赖于细胞捐赠来获得细胞来源，并且基于培养条件、生物链接成分和外部刺激对细胞分化的控制成为一项挑战。多种细胞类型(包括上皮细胞、间充质细胞、免疫细胞和内皮细胞)的共培养也被用于增加生物复杂性。Joshi等人证明了使用海藻酸丝基生物材料通过使用不同的生物链接，在同一支架内控制人类间充质干细胞分化为两种不同的细胞系，软骨细胞和成骨细胞。结果表明，藻酸盐磷酸化水平的提高促进了成骨分化，而在墨水中加入丝则促进了软骨分化。一旦细胞被纳入生物打印结构，它们的持续生长和增殖必须得到支持。3D挤出生物打印结构的血管化以支持所需的废物和营养物质运输是另一个正在进行的挑战。在人体中，每个细胞必须位于距离最近的毛细血管200 μm以内，以允许废物和营养物质的交换和运输。在3D打印结构中，这种传输通常由互连多孔网络的设计和制造来支持，这些网络允许细胞介质渗透到结构中;然而，打印分辨率是有限的，这些多孔网络是一个很差的仿生学替代天然系统的脉管系统。为了克服这个问题，一种方法是利用多材料生物打印来形成构建体，以及热敏水凝胶，然后从构建体中去除，在内皮细胞的帮助下形成血管网络。

虽然更高打印分辨率的技术能力一直在迅速提高，但使用基于挤压的技术达到细胞水平的打印分辨率仍然存在许多挑战，这可能是再现某些生物特征(如毛细血管或肺部的空气-血液屏障)所必需的。挤出打印的打印分辨率与多种因素有关，包括对挤出压力/体积、针头尺寸和生物墨水流变特性的控制。如上所述，生物材料的可打印性与其流变特性有关，由于在打印床上的扩散较小，粘性更大的生物墨水通常表现出更高的可打印性。然而，挤压粘性油墨所需的较高压力会施加较大的过程诱导力，从而降低细胞活力。因此，打印非常小分辨率特征的技术能力可能无法与生物打印的分辨率相匹配。一般来说，~100 μm的分辨率被认为是挤出生物打印在对细胞友好的情况下所能达到的最佳分辨率。

通过实验方法、模型和数值模拟对打印参数进行优化，以平衡打印分辨率和细胞活力。现象学模型也被用于描述细胞损伤程度作为所用针头和点胶压力的函数，其中模型与给定细胞类型和打印条件下实验确定的模型系数拟合细胞损伤程度。然而，评估细胞损伤和活力对应于针直径和空气压力未能捕捉到机械应力对细胞的直接机制。为了改进，一种很有前途的方法是在生物打印过程中，基于细胞损伤规律来量化细胞活力。该方法分为三个步骤:(1)建立细胞损伤或细胞损伤定律的经验模型，将细胞损伤的百分比与细胞所经历的静水压力或剪切/广泛应力的机械力联系起来(类似于牛顿第二定律，将物体的运动与施加的机械力联系起来);(2)评估细胞在生物打印过程中流动的每条细胞路径中所经历的机械力;(3)根据上述步骤的结果，确定所有细胞路径中细胞损伤的百分比，然后将它们综合起来，得到生物打印过程中细胞损伤的总体百分比，从而得到细胞活力。

重要的是，所得到的模型不仅可以用来描述细胞损伤与生物打印参数之间的关系，而且可以为制定生物打印中保持细胞活力的策略奠定基础。3D打印技术和程序的其他进步，包括自由形式可逆嵌入，也正在研究它们提高打印分辨率的能力。

仿生学通常包含多种细胞类型、细胞外基质成分和其他生物活性分子的天然组织，这些组织以复杂的结构组织以执行特定功能，是挤出生物打印的主要目标。对于组织再生，打印构建体有望模仿目标组织的复杂结构或组成，并促进功能恢复。为了实现这一目标，许多技术正在开发中，这些技术利用多种生物材料，增强可打印性，帮助血管形成，并帮助指导和控制细胞生长。

这些最近的发展和成功表明了挤出生物打印进一步发展的方向，如下所述。

多生物材料打印是指用于挤压多种生物墨水的新方法/工具的发展。这些多材料技术将有助于克服标准挤压打印的一些局限性，允许打印更复杂的结构，从而在更高程度上再现原生系统。多种生物材料打印的不同方法正在开发中，包括使用多个打印头、同轴打印和混沌生物打印。

在不同的生物墨水中预混合或混合各种细胞类型，然后使用多个打印头，每个打印一个生物墨水，是多种生物材料掺入的一种方法。通过控制单独加载的打印头的沉积，可以在不同的位置打印多个生物墨水，并组织形成复杂的支架。混合支架由赋予机械强度的3D结构框架和包含活细胞的水凝胶网络组成，是多材料生物打印的常见应用。利用3D打印的大孔PCL和预连接海藻酸盐，以这种方式开发了用于脊髓修复的管状支架，如图11所示。

图11 用多个打印头打印多种生物材料

(即PCL和海藻酸盐)的实验实例

在另一项研究中，PCL珠被装入高温打印头并在65-80℃的温度下熔化，而溶解的海藻酸-软骨细胞悬浮液被装入保持在10℃的低温打印头。每种材料交替打印，形成PCL-海藻酸盐基混合支架，由于PCL提供强大的支撑，具有良好的结构稳定性，并且由于水凝胶能够支持细胞活力，增殖和软骨分化等细胞功能，具有高生物相容性。

虽然多材料生物打印通常是在标准的挤压打印机上完成的，其中打印机在层之间交换打印头，但其他研究人员已经开发出双臂系统，允许多个打印头同时打印，以及单个打印头允许将多个生物墨水加载到不同的腔室。

为了模拟天然组织/器官的异质结构，生物打印纤维的新方法/工具正在开发，其中生物材料/细胞的分布可以纵向和/或周向控制。为此，一种新兴的技术是同轴打印，其中通过将小直径针头插入大直径针头来构建或组装一系列用于打印生物墨水的同轴管状通道。同轴打印生产的纤维由一系列同轴管状层组成，每层由生物墨水或牺牲材料制成。

同轴打印促进了具有先进结构的支架的制造，例如具有血管状通道的支架。

正因为如此，同轴打印在制造管状结构(如脉管系统、肠绒毛、毛囊和血管化骨)方面变得非常流行。对再生血管化骨的同质结构与核壳结构的差异进行的研究表明，核壳结构(核心为血管细胞，外壳为成骨细胞)导致成骨因子和血管生成因子显著增加，证明了细胞定位和相互作用对增强功能的重要性。

混合生物打印是增加打印复杂性和随后的生物相似性的另一种有前途的技术。在该技术中，使用混沌平流混合多种材料，通常是生物墨水和牺牲材料，然后通过同一个喷嘴共挤出，如图12所示。

图12 混合生物打印

(A)混合生物打印装置示意图

(B)挤压的混合长丝(海藻酸盐和C2C12- galma - alg)，

 (C)带有几个C2C12细胞的打印结构的横切面和轴向视图，

(E)包含三个Kenics静态混合器(KSM)元件的打印头示意图，

(F)每个KSM元件形成的多层结构的截面

这导致了两种材料的混合，具有高度排列的微观结构，并且在牺牲材料的情况下，微通道可以在打印链内形成。由于形成的结构与肌肉的天然结构相似，并且能够促进血管化，因此该技术已被骨骼肌领域的研究人员采用。

其他有前途的方法包括快速连续多材料挤压生物打印、嵌入式多材料生物打印和预设多材料生物打印。

嵌入式生物打印是一类先进的生物打印技术，它利用生物墨水直接挤压打印到含有镀液的介质中，如图13所示。

图13 嵌入式生物打印示意图

(A)将生物墨水打印到支撑介质中，形成复杂的3D结构

(B)打印心脏模型的侧面视图和(C)横切面视图

自由形式可逆嵌入(FRE)和悬浮水凝胶的FRE (FRESH)是属于这一类的新兴技术。与生物绘图不同(如图10c所示，其中镀液介质导致交联)，嵌入式生物打印中使用的介质镀液的主要功能是在打印后支持生物墨水。由于需要平衡黏度和打印后细胞活力，标准的挤压印刷技术通常缺乏可印刷性，而嵌入式印刷有助于克服这一挑战，允许用黏度较低的生物墨水制造极端悬垂和更复杂的设计。通过这种方式，嵌入式生物打印可以显著扩大可打印的生物墨水池。嵌入式生物打印的一个挑战是与支持介质的特性相关的挑战。除了对生物墨水及其成分无毒、生物相容性、不渗透以最大限度地减少扩散外，支撑介质还必须具有适当的流变特性，以屈服应力和粘度为特征，以允许针头在打印过程中通过介质运动，同时还必须足够强大，以支持打印后不移动的打印结构。在某些情况下，支持介质也可能支持构念的交联。常见的支撑介质包括卡波波尔、透明质酸、海藻酸盐/黄原胶、明胶/琼脂糖/GelMA和拉脱土。对于可逆形式的嵌入式生物打印（FRE、FRESH），支持介质也必须易于移除以提取打印的构建体。根据支撑介质的性质，去除方法包括升高温度使介质熔化、酶解理和简单的洗涤或稀释。FRESH已被用于周围神经再生工程，因为胶原蛋白是首选的主要生物墨水之一;然而，胶原蛋白生物墨水往往表现出非常差的机械性能和结构保真度。

研究人员成功地展示了使用钙离子结合明胶作为支持介质，用于打印含有人类雪旺细胞的海藻酸盐/胶原生物墨水，用于周围神经再生。

混合生物打印是一种用于支架制造的组合方法，它将基于挤出的生物打印与其他打印技术相结合。这种混合生物打印利用了基于挤出的生物打印以及其他技术的优势，以创建仅通过一种生物打印技术无法创建的支架。基于挤压的生物打印与静电纺丝的结合增强了生产具有不同尺度的股或纤维的复杂支架的能力。虽然挤出生物打印链的分辨率是有限的，但静电纺丝可以从聚合物溶液或熔体中制造出纳米尺度(>200纳米)的细纤维。利用集成这些技术的系统，可以生产纳米或微尺度纤维，以创建具有不同结构和环境的支架。这种支架可以增强生物功能，例如，通过纳米级纤维提供更多的细胞结合位点，促进细胞粘附。支架也可以用区域结构制造，其中每个区域由具有不同结构和环境的一种技术创建。在神经引导导管的开发中，研究人员使用了PLCL和PLGA支架，由3D挤出打印的外壁和内壁上的电纺网组成，然后涂覆聚吡咯，如图14。

图14 3D/E/PPy复合生物打印支架制造技术示意图:

(a)挤压打印制备支架，(B)静电纺丝法在3D打印支架上覆盖纳米纤维，(c)在3D/E支架上沉积PPy

主动脉弓血管移植物也使用混合技术进行了开发，在医学成像的基础上打印出原始的3D框架，然后在移植物框架上静电纺丝纤维。发育的移植物在生理压力下表现出功能，并允许整个移植物厚度的细胞浸润。

打印构建体中生物分子的控制释放对于调节诱导细胞粘附、增殖、分化和迁移等生物活动具有重要意义。在组织工程中，将来自患者或其他来源的细胞加入到打印支架中，并添加生物活性分子(或生物分子)，如GFs，以触发/促进细胞生长和/或功能。支架一旦植入受损组织/器官部位，有助于细胞再生和组织/器官功能的恢复，细胞附着、增殖和分化是成功组织再生的关键。GFs和其他生物分子激活细胞内序列信号通路并控制细胞基因表达。因此，生物分子可用性的剂量、类型、释放速率和时间影响细胞反应和功能，因此必须适当调节以促进所需组织的再生。为此，已经开发了各种方法或系统来将选定的生物分子合并或加载到打印支架中。一种很有前景的方法是使用微/纳米颗粒递送系统来保护掺入的GFs并调节其释放特征。所使用的颗粒在结构上可分为胶束、树状大分子、脂质体、固体脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒。在控释中使用的颗粒的大小范围在20到1000纳米之间变化，并影响负载生物活性分子的释放动力学。在这些系统中，聚合物纳米颗粒具有高稳定性、可生物降解性和调节GFs释放速度的灵活性等优点。研究已经开始使用含有GFs的聚合物微粒来改善血管生成以及靶递送系统的性能。

这些研究的共同点是使用单层聚合物的微颗粒来封装GFs，这种技术由于对释放剖面控制的有限改进而受到严重破坏。利用纳米技术，制备了双层纳米颗粒，结果表明，GF的顺序释放(即VEGF/bFGF联合递送后再释放PDGF)是可行且可控的。允许GF连续释放的成果将代表GF在组织工程中控制释放的重大进展。进一步开发新方法来实现GFs的时空释放以促进打印结构中的血管生成似乎是必要的，但迄今为止仍无法实现。

在构建体内打印血管网络对于维持构建体内大细胞群的生存能力和生物功能至关重要。在体内，每100 ~ 200 μm的不同组织中可见分布均匀的血管毛细血管。同样，借助支架或构建物，特别是大而厚的支架，进行组织再生，需要纳入相互连接的血管网络，以促进支架细胞与培养基之间营养物质、信号分子、氧气、生长因子、代谢废物等的大量传递。为了制造血管化支架，基于生物打印的直接和间接方法已经发展到创建毛细血管样结构或大血管。先前讨论的技术包括同轴喷嘴和混沌生物打印，它们通过在支架内生物制造含腔链直接形成这些血管网络的能力引起了人们的兴趣，类似于天然血管。在这些方法中，细胞/水凝胶混合物被用作生物连接，而生长因子通常被添加以增强生物连接的生物功能。在其他间接方法中，通过去除生物打印或其他增材制造技术产生的牺牲链，在支架内生成血管网络。迄今为止，在打印血管支架或结构方面取得了令人印象深刻的进展;然而，在生物材料的选择、细胞活力和分化、生长因子的包含，以及将这些元素整合形成具有功能血管网络的支架或构建物的方法等方面，仍有许多问题需要解决。

机器学习是一个很有前途的研究方向，可以在许多方面改进挤出生物打印。机器学习可用于预测生物油墨/支架的特性并优化打印参数，例如压力、速度和温度，并评估生物墨水的可印刷性和功能。机器学习在挤压生物打印中的一个 例子是使用 贝叶斯优化（BO）来优化生物打印性能、 例如可印刷性。虽然许多机器学习算法，尤其是深度学习算法 虽然许多机器学习算法，尤其是深度学习算法，需要大量数据才能有效、 最近算法和计算能力的进步使得 开发基于较小样本量的模型成为可能。例如，在有限数据集上训练的特定任务模型仍能 产生准确的预测或优化结果。此外，迁移 学习技术可用于利用相关领域的知识来提高模型的性能。领域的知识来提高模型的性能，即使数据有限。因此，尽管数据可用性仍是一个挑战，但将机器学习应用于挤压成型的潜在优势却不容忽视。将机器学习应用于挤压生物打印的潜在优势是巨大的，值得进一步探索。

生物墨水由生物材料和活细胞配制而成，已广泛应用于生物打印，以创建用于生物医学工程应用的3D细胞结合结构。生物墨水已广泛地由聚合物配制或合成。聚合物是具有高含水量的长链有机生物材料，因此能够提供水合组织样环境，支持细胞功能(包括细胞附着、增殖和分化)和组织再生。聚合物可以是天然的，也可以是合成的;天然聚合物(如海藻酸盐和胶原)具有支持细胞功能的内在能力，而合成聚合物(如聚己内酯(PCL)和聚乳酸(PLA))通常是生物惰性的，但具有强大而坚固的机械性能。在材料科学继续开发和合成具有更适合生物打印性能的新型聚合物生物墨水的同时，研究也开始使用两种或两种以上的聚合物或复合聚合物来配制生物墨水。此外，复合材料与无机填料的掺入改善机械性能，电学性能和生物性能，已经引起了相当大的关注，为未来的发展。

对于生物打印来说，打印生物材料的流速、形成的股线轮廓和结构、过程诱导的力以及生物材料溶液的交联都是必须通过生物墨水的流动特性、结构参数(针的形状和大小)和打印参数(打印力和针的运动)来设计和调节的重要因素。值得注意的是，在生物打印过程中，细胞受到持续的过程诱导的力，如压力、剪切应力和拉伸应力，这些力会导致细胞膜变形和破裂。虽然细胞有弹性能力抵抗一定程度的机械力，但如果施加的力超过一定的阈值，细胞膜可能会失去完整性;因此，细胞可能受损，甚至失去功能和生存能力。同时，在生物打印过程中，生物墨水一旦打印出来，仍然是溶液或半溶液形式，可以在打印床上流动或扩散。因此，印刷结构可能会与其设计不同。印刷适性用来描述这种差别的程度。

生物墨水的特性和打印参数对细胞活力和可打印性方面的生物打印性能至关重要。研究表明，生物油墨的流变特性对其可印刷性有重要影响。黏度越高的生物墨水溶液，印刷性能越好，因为高黏度往往会减少生物墨水的流动/扩散。另一方面，被封装的细胞在粘性较低的生物墨水溶液中存活得更好，而粘性较低的生物墨水需要相对较小的机械力来进行生物打印，从而减少了过程诱导的力，进一步保持了细胞的活力。研究还表明，所使用的生物墨水交联机制和交联后的机械性能对细胞活力和可打印性都有显著影响。为了保持可印刷性，生物油墨需要快速交联。

由于打印的结构为细胞提供了支持细胞功能和组织再生的生物力学环境，支架的降解和随后的机械强度下降必须与结构内细胞生长和组织再生引起的机械强度增加相平衡。人们普遍认为，为了最好地支持细胞活力和其他功能，以及组织再生，构建物的机械强度应该与被修复的组织/器官相似。

多种材料和细胞的生物打印支架已经引起了相当大的关注，这与模仿天然组织成分的努力有关。各种基于挤压的生物打印技术已经得到了发展和进步，如嵌入式生物打印、多头生物打印、同轴生物打印和混合生物打印。更先进的基于挤压的生物打印技术有望在未来开发用于类组织支架的制造。

本文转载自公众号：本草墨源

文案：董乐轩

文献原文：10.1016/j.bioactmat.2023.06.006

文献链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X23001809?via%3Dihub=

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