《Biomaterials Science》：基质硬度和簇大小共同调节脑转移性乳腺癌细胞簇的休眠与增殖
美国阿拉巴马大学Shreyas S. Rao团队利用不同硬度的HAMA水凝胶来模拟大脑微环境，脑转移性乳腺癌细胞（MDA-MB-231Br）细胞球体被用来模拟细胞簇，进而探究肿瘤细胞簇-器官微环境的相互作用及其对癌细胞簇的休眠与增殖表型方面的影响。其研究文章发表“Matrix stiffness and cluster size collectively regulate dormancy versus proliferation in brain metastatic breast cancer cell clusters”在Biomaterials Science上。
研究背景
乳腺癌细胞转移到远处器官的能力占乳腺癌相关死亡率的约90%。确切地说，乳腺癌细胞可以转移到肺、脑、肝、骨和淋巴结。在某些情况下，转移可能发生在原发肿瘤被发现之前。此外，研究表明与单细胞迁移和侵袭相比，集体细胞迁移(即作为细胞簇)和传播表现出明显更高的进化为转移的可能性。然而，转移性肿瘤细胞簇在器官部位定植的调节机制尚不清楚。越来越多的证据表明，在播散和转移之间存在一段潜伏期。在此期间，肿瘤细胞可能进入休眠状态，此时细胞要么生长受阻(细胞休眠)，要么通过肿瘤内发生的细胞凋亡来平衡细胞的生长(群体休眠)。肿瘤微环境在调节休眠表型中对播散的肿瘤细胞起重要作用。细胞基质(ECM)对于决定扩散的肿瘤细胞的命运至关重要，合适的仿生体外模型在研究肿瘤休眠，捕捉细胞- ECM的相互作用具有重要价值。
研究结果
尽管肿瘤细胞团簇比单个细胞具有更高的转移潜力，但肿瘤细胞团簇与脑微环境之间的相互作用尚不清楚。作者配制软(0.4 kPa)和硬(4.5 kPa)的HA水凝胶来模拟天然脑ECM的刚度范围(0.2-1 kP)和转移性脑恶性肿瘤的刚度范围(3.7 kPa)。临床已检测到循环肿瘤细胞(CTC)簇，主要由2至100个细胞组成这里，为了评估簇大小的影响，使用六种不同的细胞密度(即100、500、1k、2k、5k和10k细胞)制备了细胞球体，将这些细胞球体转移到不同的培养条件下，培养7天。第0天时显示细胞紧密地定位在球体中。在2D TCPS上贴壁培养的细胞球体表现出增强的生长特征，细胞开始在TCPS上扩散，在细胞密度较高的情况下，第7天所有细胞球体的面积至少是第0天面积的10倍。结果表明培养条件对悬浮培养和软质或硬质HA水凝胶培养的细胞球体面积的影响。在球体数为100和500的情况下，从第0天到第7天，随着细胞球体面积的增加，悬浮培养的球体呈线性增长趋势。相比之下，在软质或硬质HA水凝胶上培养的100和500细胞球体面积在整个培养期间基本保持不变。对于1k和2k细胞球体，悬浮培养的第7天球体面积是第0天的7倍，而在软质HA水凝胶上培养的1k和2k细胞球体面积从第0天到第7天基本保持不变。然而，在第7天结束时，与软质透明质酸水凝胶相比，硬质透明质酸水凝胶上培养的1k和2k细胞球体的面积略有增加。当培养上软透明质酸水凝胶，5k和10k细胞球均表现出休眠表型，其中细胞球形区居多在整个时期不变。相比之下，在硬HA水凝胶，面积为5k和10k细胞球体显著增加，随着第7天面积的增大细胞球面体比软HA水凝胶表面的细胞球面体高1.8倍。
图1 脑转移性乳腺癌细胞球体在7天内表现出不同的生长反应取决于培养条件和球体大小。
BCBM细胞球状体表现出三种不同的表型生长模式取决于培养环境。当BCBM细胞球体悬浮培养时或贴壁培养，他们表现出与预期一致的增生表型。当BCBM细胞呈球状时在软质透明质酸水凝胶上培养，与刚性HA水凝胶相比为休眠表型。此外，在坚硬的羟基透明质酸凝胶上培养的细胞球体显示出在休眠和休眠之间的大小依赖切换增生性表型。有趣的是，到第7天，在坚硬的HA水凝胶上培养的10k细胞球体中，观察到硬度介导的细胞从细胞球体迁移和微集落形成。相比之下，当10k细胞球体在软HA水凝胶培养7天，球体在整个培养时间内呈现相同的形态。然而，在第7天，注意到细胞在距离球体显著距离(375±61µm)处迁移和微集落形成，形成的微型菌落的最大面积与100细胞球体相似区域;这些微型菌落和100个菌落一样紧凑细胞球体。以上这些结果表明培养环境，细胞簇的大小，还有ECM刚度在调节细胞簇生长中起关键作用。
图2 与在软质HA水凝胶(0.4 kPa)上培养的细胞相比，在硬质HA水凝胶(4.5 kPa)上培养的10k细胞球体中观察到硬度和大小诱导的微菌落迁移和形成。
由于在软质或硬质透明质酸水凝胶上培养的细胞球体表现出休眠和增殖表型，作者试图量化细胞球体中增殖细胞的百分比。首先，直接对软质和硬质HA水凝胶培养的细胞球体进行Ki67染色。无论水凝胶硬度如何，100, 500, 1k和2k细胞球体大部分为Ki67阴性。然而，与软质HA水凝胶培养的细胞球体相比，硬质HA水凝胶培养的5k和10k细胞球体显示出一定程度的Ki67阳性，表明存在增殖细胞。细胞球体的Ki67染色直接定性地证明了大小依赖性的休眠与增殖表型在硬HA水凝胶和休眠表型在软HA水凝胶，无论簇大小。同时，在坚硬的HA水凝胶上形成的10k细胞球形微菌落表现出Ki67阳性，然而，直接在坚硬的HA水凝胶上种植的类似大小的100细胞球形微菌落大部分呈Ki67阴性。
为了获得定量结果，作者使用10k的细胞将球体分离成单个细胞并对其进行Ki67染色。结果显示，硬质HA水凝胶培养的球形细胞中Ki67阳性细胞数量是软质HA水凝胶培养的2倍。从悬浮和贴壁培养的10k细胞球体中获得的单细胞也进行了Ki67染色，表明悬浮培养中存在32.6±0.2%的Ki67阳性细胞，贴壁培养有52.6±3.8%的Ki67阳性细胞。与软质透明质酸水凝胶相比，悬浮和贴壁培养的10k细胞球体中Ki67阳性细胞的数量显著增加。除了Ki67外，作者还通过将EdU加入到新合成的DNA中，评估了10k细胞球体中存在的增殖细胞的百分比。在第7天对软质或硬质HA水凝胶上培养的10k细胞球体以及悬浮和贴壁培养进行EdU染色。与Ki67染色一致，在10k细胞球体中，硬质HA水凝胶中EdU阳性细胞的百分比明显高于软质HA水凝胶。特别是，软质HA水凝胶培养的球体中有16.4±1.5%的EdU阳性细胞，而硬质HA水凝胶培养的球体中有37.5±0.9%的EdU阳性细胞。与软质和硬质HA水凝胶培养的球形细胞相比，悬浮培养的10k球形细胞(54.9±2.2%)和贴壁培养的10k球形细胞(72.8±1.5%)中EdU阳性细胞的百分比显著高于硬质HA水凝胶培养的球形细胞。
作者进一步对10k细胞球体进行vimentin(间充质标记物)，E-cadherin(上皮标记物)和F-actin的免疫荧光染色。结果显示与软质HA水凝胶相比，硬质HA水凝胶上10k细胞球体中vimentin阳性细胞的百分比增加，E-cadherin阳性细胞的百分比很低，并且在软质和硬质透明质酸水凝胶上相似。从10k细胞球体迁移到硬质HA水凝胶上的细胞在球体外围和微菌落附近呈扩散形态，肌动蛋白细胞骨架发达，而在软质HA水凝胶上，沿着10k细胞球体外围未见突起。利用Annexin-V和cleaved caspase-3染色定量10k细胞球状体中的凋亡细胞，并检测软质透明质酸水凝胶上观察到的休眠表型是由于ECM僵硬，而不是由于细胞凋亡导致的细胞死亡。总之，这些结果表明，在软质透明质酸水凝胶上培养的球体表现出休眠表型，而在硬质透明质酸水凝胶上培养的球体表现出大小依赖的休眠与增殖表型。
图3 与硬质透明质酸水凝胶(4.5 kPa)相比，软质透明质酸水凝胶(0.4 kPa)上培养的10k球体中的脑转移性乳腺癌细胞Ki67阴性，表现出休眠表型。
众所周知，微环境引起的休眠肿瘤细胞或细胞簇的重新唤醒会导致转移部位的疾病复发。对ECM的修饰会导致单个休眠癌细胞的重新唤醒。在此，作者验证了ECM刚度是否诱导的休眠表型是可逆的。在本研究中，10k细胞球体在软质HA水凝胶上培养7天，之后，收集球体并转移到新鲜制备的软质或硬质HA水凝胶上，并再培养7天。在软质透明质酸水凝胶上，10k细胞球体在最初7天表现出休眠表型，随后转移到新的软质透明质酸水凝胶上(软到软)，直到第14天都表现出类似的表型。转移到坚硬的HA水凝胶(从软到硬)后，观察到细胞从球体迁移，但在培养期间没有观察到微菌落的形成。此外，第14天软质HA水凝胶条件下的细胞球体面积显著高于软质HA水凝胶条件，表明休眠到增殖的转换。
图4 在软HA水凝胶(0.4 kPa)上观察到的10k细胞球体的僵硬诱导休眠表型是可逆的。
Ki67染色进一步支持了这些结果。在软硬HA水凝胶上培养14天的球状体中，Ki67阳性细胞的百分比比软硬HA水凝胶高2倍。特别是，19.2±1.6%的细胞在软到硬的HA水凝胶中Ki67阳性，而在软到软的HA水凝胶中为9.2±0.8%。此外，作者还评估了休眠球体在转移到2D TCPS(即软到贴壁)培养条件下是否能获得增殖表型。在软质透明质酸水凝胶上培养7天后，将10k细胞球体转移到二维TCPS上。在另外7天的培养过程中，将这些休眠球体转移到2D TCPS也触发了表型从休眠到增殖表型的转换。其中，软-贴壁培养的细胞球体面积显著高于软-贴壁培养。此外，软贴壁条件下Ki67阳性细胞的百分比(34±3%)比软贴壁条件(9.2±0.8%)高~ 3.5倍。调节培养环境导致细胞从球体迁移，而在类似的微环境(即软HA水凝胶)中培养时，球体保持休眠表型。综上所述，这些结果表明，观察到的休眠表型确实可以通过调节培养环境来逆转。
图5 与从软质HA水凝胶(0.4 kPa)转移到软质HA水凝胶(4.5 kPa)相比，10k细胞球体中的脑转移性乳腺癌细胞在第14天表达了更高的Ki67阳性百分比。
研究结论
作者成功地利用具有可变刚度和六种不同大小的细胞球体的仿生透明质酸水凝胶来评估ECM刚度和簇大小对脑转移性乳腺癌细胞簇休眠和增殖表型的影响。BCBM细胞球体在软质HA水凝胶上培养时达到休眠表型，而在硬质HA水凝胶上，它们表现出休眠和增殖表型之间的大小依赖转换(即增殖表型≥5000细胞<休眠表型)。此外，在硬质透明质酸水凝胶上观察到10k细胞球体形成微集落。作者还证明了刚度引起的休眠是可逆的。这种生物材料系统为探索BCBM中的细胞簇-基质相互作用提供了有利的工具，并可用于抗肿瘤转移药物的筛选 。
文案：李小慧｜排版：沈巍豪
文献原文：10.1039/d0bm00969e
文献链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/bm/d0bm00969e
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