《INT J BIOL SCI》：小鼠睾丸类器官再现睾丸结构与分子特征

近日，以色列巴伊兰大学生命科学学院和纳米技术与先进材料研究所Aviya Stopel等人成功在实验室中培育出具有类似睾丸结构和功能的小鼠睾丸类器官。这些类器官可以在培养中维持8-9周，并显示进入减数分裂的迹象。并进一步开发了明确的培养基成分，以促进未成熟的支持细胞和成熟的间质细胞状态，使体外类器官成熟。这些类睾丸器官为睾丸发育和功能的基础研究提供了一个很有前景的模型系统，在解释和治疗发展性障碍和不孕症方面具有转化应用价值。

图1：在transwell插入物上建立初生新生儿睾丸类器官

由于肾脏和性腺具有共同的中胚层发育起源，并且它们都具有管状结构，因此研究人员们探索了使用transwell插入物来产生睾丸类器官。非常显著的是，形成了美丽的睾丸类器官，具有清晰的管状结构和非常强的CFP或GFP表达，在培养中持续了21天。这些类器官可以培养长达9周，同时仍保持致密的类器官形态和清晰的管状结构。然而，培养9周后，它们开始崩溃。对类器官面积的测量表明，在整个9周的培养期间，它们的大小继续增长（图1）。

图2：体外培养类器官、新生儿和成人睾丸基因表达谱的比较

对类器官的基因表达谱进行了评估，并与体内睾丸进行了比较，首先关注的是支持细胞特异性标记物，因为支持细胞是睾丸的组织中心。在8周的类器官培养期的不同阶段测量基因表达，与P4-P7睾丸(类器官产生的参考点)、P28睾丸(对应终点)、D21类器官和P90成年睾丸进行比较。总之，这项基因表达分析表明，在transwell设备上具有特定培养基的类器官培养可以支持多种睾丸细胞类型的长期培养和存活，并保持与体内睾丸相似的基因表达谱（图2）。

图3：睾丸类器官呈现管状结构，并保留主要的性腺细胞类型

为了探索是否所有主要的睾丸细胞类型都存在于类器官中，并确定它们的空间组织，第21天(D21)类器官用不同细胞类型的各种标记进行免疫染色(图3A)。用SOX9、AMH、CLD11(支持细胞)、3ßHSD(间质细胞)、DDX4(性腺细胞)和α-SMA (PM细胞)对整个D21类器官进行免疫染色表明，在21天的培养过程中，所有主要睾丸细胞类型都存在于类器官中。这些数据表明，体外睾丸类器官形成的腔室和结构与体内睾丸的结构非常相似，并能长时间保存所有主要细胞类型（图3）。

图4：胚胎睾丸类器官培养的建立

学者们将建立的新生儿睾丸类器官的相同设置应用于从胚胎性腺产生的睾丸类器官。为了更好地表征体外培养14天的胚胎睾丸类器官，对全株D14类器官进行免疫染色，以标记各种性腺细胞类型。研究结果表明，应用transwell系统，加上明确的培养基，适合于胚胎和新生儿睾丸类器官的形成，这些类器官可以长时间保存大多数性腺细胞类型，并且高度类似于睾丸室和结构（图4）。

图5：不同培养基成分对新生儿类器官体外成熟的影响

研究人员发现 Transwell 系统中成年睾丸细胞不能形成类器官。因此，他们尝试使用特定培养基将新生睾丸类器官成熟到成年睾丸状态。使用定量PCR方法测定未成熟和成熟状态之间Sertoli标记物的表达水平，发现含有B27的未成熟培养基能够促进未成熟 Sertoli 细胞状态，而含有 B27 的成熟培养基则能更好地促进成熟 Sertoli 细胞状态。然而，在培养基中添加 KSR 会掩盖为促进不同细胞状态而添加到培养基中的生长因子的作用。此外，研究人员发现，未成熟的B27基培养基能够促进类器官的增大，而成熟的B27基培养基则导致类器官大小减小。相比之下，以KSR为基础的培养基对类器官大小的影响不大。进一步研究显示，在未成熟培养基中生长的类器官大小显著增加，而在成熟培养基中培养的类器官大小没有变化。在过渡培养基中，使用未成熟培养基培养时，类器官大小显著增长，而在成熟培养基中生长时，大小没有显著增长。研究人员发现，在D14和D21时，成熟2培养基和过渡培养基中生长的类器官中Amh和Cx43的表达水平低于未成熟培养基。Sox9的表达没有明显变化。这些数据表明，通过控制培养基成分和添加的生长因子，可以维持和促进类器官中支持细胞的未成熟和成熟状态（图5）。

图6：SSC在体外睾丸类器官内进入减数分裂

为了确定类器官是否支持精原干细胞进入减数分裂，首先在确定的培养基上培养D21类器官，与减数分裂标记γH2AX(标记DSB)和DDX4(标记SSC和精原细胞的所有阶段)共同染色。接下来，研究者们分析了在过渡培养基上培养的D7和D42类器官是否也存在DDX4和γ - h2ax的共染色。虽然在D7类器官中很少有细胞共染色，但在D42类器官中有许多细胞共染色。总之，这些发现表明体外类器官培养可以支持SSC进入减数分裂，有些甚至可以完成精子发生并形成含有ACROSIN的精子头（图6）。

总之，研究者们在transwell插入物上从胚胎和新生儿睾丸中生成睾丸类器官，并表明它们在基因表达和空间组织方面与体内睾丸非常相似，并可维持长达9周。该系统的进一步改进和适应，包括过渡到人类睾丸，将使其成为一个容易探索睾丸功能和发育的平台，并探索不同性腺细胞之间的相互作用。

文案：冯天意｜排版：沈巍豪

文献原文：10.7150/ijbs.89480

文献链接：https://www.ijbs.com/v20p1024.htm