《Advanced Science》：生物工程水凝胶重现癌症中成纤维细胞的异质性

新加坡国立大学的方婷婷博士和伊耶尔博士研究项目生物工程水凝胶重现癌症中成纤维细胞的异质性《Bioengineered Hydrogels Recapitulate Fibroblast Heterogeneity in Cancer》于24年3月发表在Advanced Science上。他们的研究方向主要为3D肿瘤模型的建立以及生物材料在肿瘤微环境中的应用。

1.肿瘤微环境中单个 CAF 亚群的功能分析对于开发更准确的 CAF 靶向治疗策略至关重要。然而，目前缺乏体外反映CAF异质性的稳健的临床前模型

 2.对成纤维细胞的研究表明成纤维细胞对体外培养条件高度敏感，不同的研究小组报道了水凝胶硬度和降解性能够影响成纤维细胞中的YAP/TAZ信号，说明了通过调节基质属性，在体外产生不同的CAF亚群的可能性。

因此，在这次研究中作者利用从患者来源的头颈部鳞状细胞癌中获得的转录数据集来指导水凝胶设计，以实现在体外生成myCAF和iCAF的目的。

作者对10 例头颈部鳞状细胞癌患者肿瘤进行单细胞测序，利用成纤维标志物从数据集中鉴定出成纤维细胞，并进一步根据CAF 在2D UMAP 空间中表达不同的基因集确定了四种亚簇，并在所有患者中验证了四个亚簇的存在。基因富集分析发现0簇CAF与ECM 和细胞骨架通路相关，这个特征常见于 myCAF。1-3簇CAF显示出免疫相关通路相关，其中1簇CAF和2簇CAF分别与 IFN（干扰素） 和 IL（白介素） 信号传导相关，而补体通路在3簇CAF中被激活。此外，3簇CAF 与代谢、RNA 和蛋白质加工途径相关。但与其他研究比较，3簇CAF 上调 CD74，但不上调 apCAF特征基因。与先前被描述为 myCAF 祖细胞的脂肪基质细胞 （ASC） 最相似。因此，基于这些分析，作者将0-3簇CAF 分别称为 myCAF、IFN-iCAF、IL-iCAF 和脂肪样 CAF （adipoCAF）。

基于细胞微环境中的物理和化学刺激可以影响转录因子活性，作者在确定头颈部鳞状细胞癌中不同的 CAF 亚群后，假设转录因子 （TF） 活性和配体-受体相互作用可能有助于揭示每个 CAF 亚群身份的微环境线索。基于pySCENIC预测的TF活动重新绘制CAF数据显示，4个CAF簇基本保留，使用Slingshot算法在pySCENIC衍生的UMAP上进行了轨迹分析，将脂肪样CAF子集作为起始簇以确定myCAFs和IL-iCAFs是否可以像之前报道的那样相互过渡。结果显示在三个预测轨迹中，所有轨迹都通过 IFN-iCAF，表明IFN-iCAF是一个中间子集，可能同时产生myCAF和IL-iCAF。并且TF轨迹还表明myCAF和IL-iCAF状态之间存在可塑性，说明了通过外援性干涉逆转CAF亚型的可能性。进一步差异转录因子活性分析显示，myCAF 具有更高的 FOSL2 和 CREB3L1 活性，而 IL-iCAF 具有更高的 RELB 和 POU2F2 活性。其中CREB3L1上调 ECM 和 myCAF 相关基因，例如 COL1A1， iCAF通过 RELB介导JAK-STAT 信号转导和 NF-κB 活性已有报道。通过调查每个TF目标的归一化富集分数（NES），并对可以从一个目标过渡到另一个目标的CAF簇进行两两比较，观察到相同的TF与每个CAF子集的上调标记相关联。进一步分析与每个CAF亚群相关的配体-受体相互作用，发现所有CAF亚群都参与了ECM-整合素的相互作用。然而，与其他CAF子集相比，这些相互作用在myCAFs中更为突出。这些分析表明提供促进细胞张力和整合素粘附的条件可能能够分化出myCAF。因此，作者假设具有整合素结合基序的可降解水凝胶将促进细胞扩散并对 CAF产生细胞收缩性，从而支持 myCAF 表型。相反，iCAF表型可以在没有整合素结合基序或不可降解的水凝胶中被诱导。

作者使用有利于肿瘤和基质培养的硫代HA水凝胶系统，将RGD肽基序与HA偶联以调节整合素结合。将基质金属蛋白酶敏感序列与水凝胶交联以调节水凝胶降解性。

作者将患者来源的CAF封装在三种不同的水凝胶条件下：可降解具有整合素基序水凝胶（D/IB），可降解水凝胶不具有整合素基序的水凝胶（D/nIB）和不可降解具有整合素基序的水凝胶（nD/IB）。在D / IB水凝胶中的CAF能够附着在周围的基质上并扩散，细胞圆度和球形度随时间推移而降低，并且CAF变为了更像纺锤体的形态。而缺少整合素结合其中的 CAF 保持球状形态。值得注意的是，与D/IB水凝胶中的细胞不同，nD / IB水凝胶中的细胞仍可能形成小突起，主要在圆度上适度降低，但球形度中变化较少。作者还进行了初步实验以确定 CAF 形成预期形态的持续时间（HN217P 为 6 天，HN294P 为 9 天，HN338P 为 5 天）。这些确定的时间点被用于所有后续实验。

为了研究观察到的形态变化是否与特定的CAF亚群相关，作者使用CAF亚群特异性标记对这些培养物进行RT-qPCR。培养开始时的CAFs相对相似，除了D/nIB水凝胶中表达较高水平的IL24和TMEM158。与D/IB水凝胶中的CAF相比，nD/IB水凝胶中的CAF在最终时间点表达相对更高的IL24和CXCL8，D/nIB水凝胶中的CAFs也观察到类似的趋势。虽然myCAF相关基因的表达没有显着差异，但与其他水凝胶中的CAF相比，D/IB水凝胶中myCAF的表达水平在最终时间点更高。这些结果表明，封装在 D/nIB 水凝胶中的 CAF 在整个培养过程中更像 IL-iCAF，在培养结束时，D/IB 水凝胶中的 CAF 比其他两组更像 myCAF。

为了在更广泛的层面证实这些，作者将在不同水凝胶条件下培养的CAF以及2D孔板上培养的CAF进行批量RNAseq，结果显示myCAFs在2D培养物中占主导地位，这与2D培养的CAF多形成纺锤形形态的观察结果一致。在将这些 2D 培养的 CAF 封装到三种水凝胶条件下后，虽然所有培养物都含有 2 至 4 个 CAF 亚群的混合物，但每个 CAF 亚群的比例存在显着差异。与其他两组水凝胶组相比，D/IB水凝胶内的myCAFs比例最高、IL-iCAFs的比例最低，证实了先前的qRT-PCR结果。另一方面，与D/IB水凝胶组相比，另外两组水凝胶条件支持较高比例的IL-iCAFs和较低比例的myCAFs。

在基因层面，与D/nIB水凝胶组相比，nD/IB水凝胶组的CAF具有更高的IL-iCAF相关基因表达，更有利于IL-iCAF的产生。与体内对应物相比，这些体外CAF中也富集了相似的生物学途径：如D/IB水凝胶中CAF的肌动球蛋白结构组织，以及nD / IB水凝胶中CAF的白细胞介素信号传导。

最后，作者使用源自 scRNAseq 的差异表达基因集进行基因富集分析，以计算培养的 CAF 和体内 CAF 亚群之间的相关性评分。允许 CAF 扩散 的D/IB水凝胶组诱导了强烈的 myCAF 表型，而不可降解的 nD/IB水凝胶则诱导了的树突状和球形是 IL-iCAF 表型。相比之下，D/nIB 中的圆形和球形 CAF 既不是 CAF 亚群特异性的，也不是 myCAF 或 IL-iCAF 样的。

接下来，作者探究了使用不同水凝胶条件得出的CAF亚群中是否具有相似的转录因子活性，作者使用ARACNe-AP和基因富集分析鉴定了每种水凝胶条件下与CAF基因特征相关的转录因子。将这些与前文进行比较，观察到D / IB水凝胶中的CAFs与体内myCAFs之间的一致性为70.8%。这包括体内 TF，例如 FOSL2、CREB3L1 和 TEAD1。nD/IB凝胶中体内IL-iCAFs和CAFs之间的相似性较低，为56.3%，但仍将RELB和POU2F2确定为关键TF。重要的是，虽然2D培养的CAFs表现出肌成纤维细胞特征，但与体内myCAFs的转录因子活性相似性仅为51.5%，低于D/IB水凝胶培养的CAFs。

接下来，作者探究了是否可以在这些培养物中使用特定的转录因子抑制药物来靶向CAF亚群，维替泊芬靶向YAP / TEAD、QNZ靶向NF-κB。对维替泊芬或QNZ处理的培养物的形态学分析显示，维替泊芬诱导体外myCAF群体变得更圆和更偏向球形。这与体外 myCAF 中 myCAF 相关基因表达的下降趋势有关 。

相比之下，QNZ可能在体外IL-iCAF中诱导某些IL-iCAF标志物的表达较低，例如IL6。

总体而言，与各自的对照组相比，维替泊芬处理的myCAF和QNZ处理的IL-iCAF的基因表达谱评分产生了相似的结果。因此，TEAD 和 NF-κB 可能不是 myCAF 和 IL-iCAF 中基因表达的唯一调节因子，但肯定对 CAF 可塑性具有功能影响

考虑到形态与形成myCAF或IL-iCAF表型之间的关联，作者探究了微管动力学和/或肌球蛋白收缩特性是否有助于在体外维持这些CAF亚群。结果显示肌动球蛋白靶向药物(ROKI和BLOBBISTING)不改变体外培养的myCAF和IL-iCAF的基因表达谱。然而，微管靶向药物，特别是诺康唑在体外的myCAF中显著诱导了更多的IL-ICAF样表型。此外，myCAF到IL-iCAF基因表达谱的显著变化与圆度和球度的增加相关。

此外，myCAF到IL-iCAF基因表达谱的显着变化与圆度和球形度的增加相关。与对照组相比，诺康唑和紫杉醇导致几乎所有细胞都趋向更圆更球形，肌动球蛋白靶向药物对体外 myCAF 没有影响，其保持树突状并扩散 。

鉴于紫杉醇用于治疗头颈部鳞状细胞癌患者以及观察到的在紫杉醇治疗 myCAF 后从 myCAF 到 IL-iCAF 表型的转变，作者随后使用离体患者来源的肿瘤外植体模型来验证这些结果。作者将肿瘤外植体暴露于紫杉醇或DMSO（对照）中，结果显示用紫杉醇治疗时，体外 myCAFs 和 PDPNα-SMA myCAF 分别显示 ACTA2 和 α-SMA表达降低。然而，虽然紫杉醇诱导体外IL-iCAFs中IL6表达略有增加，但PDPNIL-6 IL-iCAFs并未显示IL-6表达的显着变化

鉴于myCAF和IL-iCAF对微管靶向药物的反应不同，作者假设它们会对癌细胞的药物敏感性产生不同的影响。为了验证这一点，作者将来自myCAF和IL-iCAF的条件培养液来预培养肿瘤，使其生长为肿瘤球状体。然后将紫杉醇处理的myCAF和/或IL-iCAF的条件培养液在紫杉醇存在的情况下应用于肿瘤球状体，以总结紫杉醇在体内治疗肿瘤的情况。

为了解决患者中不同CAF亚群的不同比例，作者还以几种比例混合培养基以阐明复合效应。有趣的是，只有当myCAF和IL-iCAF条件培养基以1：2的比例混合时，肿瘤球状体才可能对紫杉醇更敏感

因此，作者后续考察了这些发现是否可以在临床上观察到。利用癌症基因组图谱的数据，作者确定了接受微管靶向治疗(紫杉醇或多西紫杉醇)的头颈部鳞状细胞癌患者。并根据单样本GSEA确定的myCAF和IL-iCAF的相对丰度对患者进行分层。数据分析表明，myCAF和IL-iCAF的相对丰度，而不是各自的丰度，影响了接受紫杉醇或多西紫杉醇治疗的患者的总体存活率。

较低的myCAF/IL-iCAF丰度是头颈部鳞状细胞癌患者最差的预后。中等的myCAF/IL-iCAF丰度是最好的预后，这反映在当存在1：2myCAF：IL-iCAF条件培养液时，肿瘤球状体的存活率降低。当对没有接受紫杉醇或多西紫杉醇治疗的头颈部鳞状细胞癌患者重复相同的分析时，我们发现这两种CAF状态与总体生存率之间没有相关性。

综上所述，这些结果表明，紫杉醇和多西紫杉醇的益处可以部分地通过诱导myCAF中更多的IL-ICAF样状态来实现，但前提是首先存在一些IL-iCAF。因此，这些发现强调了微管动力学可能在从myCAF向IL-iCAF转变的过程中发挥重要作用；靶向微管可能会使myCAF/IL-iCAF中等丰度的患者受益。

1.不同于研究硬度对CAF亚型生成的影响，作者利用TF 和 CCN 分析发现，在整合素配体存在下调节水凝胶降解以控制细胞扩散确实诱导CAF形成myCAF 或 iCAF 状态，这表明细胞张力可能在控制 CAF 可塑性方面起着重要作用。

2.文章中使用的水凝胶仅限于纤连蛋白衍生的RGD肽。其他微环境组成部分的作用仍未得到探索

3.文章中产生的CAF亚群在不同的水凝胶基质中培养。鉴于CAF亚群相对丰度的重要性将 myCAF 和 iCAF 掺入同一基质中以与癌细胞共培养非常重要。

1、作者根据体内转录组数据，如来自HNSCC患者scRNAseq数据的转录活性和预测的配体-受体相互作用，表明myCAF和IL-iCAF微环境存在差异，说明能够将其部分掺入可调水凝胶系统中以生成不同CAF亚群的模型。

2、不同于先前研究的水凝胶刚度会介导不同CAF亚群的产生 ：如较软的基质有利于产生myCAFs，使细胞扩散成为可能，较硬的基质有利于产生iCAFs。在作者的研究中发现，myCAF 和 iCAF 可以使用具有相似初始刚度值的水凝胶产生，这表明 myCAF-iCAF 开关不仅仅受水凝胶刚度的调节。其中微管抑制能够影响 myCAF 群体，将 myCAF 转换为 IL-iCAF 样状态。

综上，利用体内转录组数据指导水凝胶参数的选择，本研究使用生物工程水凝胶在HNSCC中建立了不同CAF亚群的体外培养。这些体外myCAF和IL-iCAF培养揭示了微管靶向标准护理药物对不同CAF亚群的影响。

本文转载自公众号：本草墨源

文案：赵培媛｜排版：沈子皓

文献原文：10.1002/advs.202307129

文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202307129