《Frontiers in Physiology》：3D打印支架培养小鼠睾丸类器官

比利时，布鲁塞尔自由大学医学院睾丸生物学实验室Guillaume Richer等人用3D打印的单层支架(1LS)在空气-介质界面上生成了两种不同小鼠品系的睾丸类器官(TOs)，显示了小管样结构和间质细胞的功能，支持生殖细胞的长期存活并分化到减数分裂期。将原代睾丸细胞和EGFP+生殖系干细胞(GS)混合培养成嵌合TOs，在双层支架(2LSs)中培养，以获得更好的包埋效果。他们显示了一个改进的球体形态，包括一个完整的小管样结构和周围的间质，代表睾丸的功能单位。

在小管室中，支持细胞通过精子发生的不同阶段直接滋养生殖细胞:从基底膜上的精原干细胞(SSC)到减数分裂后的精子细胞流向管腔。生殖细胞的命运也取决于来自小管间质室的分泌物，如间质细胞产生的睾丸激素。由于睾丸微环境中信号信号的高度协调性质，体外精子发生(IVS)培养物重建模拟睾丸两个结构室的条件至关重要。

支架的设计与制备

两种小鼠品系1LS的原发TOs均能恢复体内睾丸组织学

当原代睾丸细胞在琼脂糖支架上培养而不划界时，它们可以自我重组成没有大小限制的结构(图1E)。为了确定睾丸细胞重组的区域，作者用细胞互作材料打印了大孔1ls(图1A,C, 2A)。在基础培养基中培养6周后，两个小鼠品系的睾丸细胞自我重组为具有一个或多个不同的小管样结构的类器官，包括管腔、上皮和管管壁，并被间质包围(图2B,C)。这些TOs是健康的，因为没有局部细胞死亡的迹象(图2D)。然而，当邻近毛孔的细胞聚集时，形成显示核心变性迹象的大TOs(图2D，补充图1A)。两种菌株的1LSs中TOs的管状结构显示出相似的体细胞标记空间排列，与其体内表达谱相似(补充图1B-E): Leydig (3ß-HSD+)和细长的管周肌样细胞(ACTA2+)在含有支持细胞(SOX9+)的小管基膜(LN+)周围重组，这些细胞通过紧密连接(ZO1+)相互连接(图2)。

对照小鼠成年睾丸组织免疫荧光染色

原发性1LS-TOs的生殖细胞动力学变化及类固醇活性检测

通过DDX4的表达和γ - h2ax的核分布来确定精母细胞的减数分裂阶段。在体内，细线素精子细胞表现为微弱的DDX4和明亮的γ - h2ax信号(补充图1G，白色三角形，图1)，而γ - h2ax强度随着精子细胞进入受精卵期而减弱(补充图1G，白色箭头，图2)。粗线素精子细胞表现为明亮的DDX4染色和性囊内γ - h2ax聚集灶(补充图1G，白色箭头，图2)。虽然所有的生殖细胞在培养前都处于减数分裂前，但在第6周，超过50%的生殖细胞已经发展为瘦素(图2J，白色三角形)或合子素(图2J，白色箭头)精母细胞(图3B,C)。然而，粗线精母细胞缺失。这些发现表明，在这两个菌株的TOs中，减数分裂进程在合子期被阻止。重要的是，与培养开始时相比，生殖细胞的比例在第6周显著降低(图3A)。

在整个培养期间，通过测量培养基中的睾酮浓度来量化TOs中间质细胞的类固醇生成活性，并比较菌株之间随时间的波动(图3D)。

2LS荧光染色鉴定

嵌合TOs在正常2LSs中表现出统一的形态，并恢复了SSC生态位的成分，但显示出生殖细胞的损失。常规Cellink(图4B-D)和Cellink- rgd 2ls(补充图2E)在培养1周后均产生相似的单球状聚集体。然而，当聚集体在Cellink 2LSs中自由漂浮时(图4B,C)，它们粘附在Cellink- rgd 2LSs上(补充图2E)。然而，水凝胶的类型对组织学没有明显的影响，因为所有样品都显示出绳状结构的形成(图4B,C;补充图2E)。

此外，在嵌合聚集体的中心和周围可以观察到DDX4阳性的EGFP-GS细胞(图4D，白色箭头)。值得注意的是，检测到死亡细胞，但仅在发育中的类器官的周围(图4G)。

鉴定种系干细胞(GS)和双层支架(2LS)的培养

由于水凝胶的类型在短期培养过程中不影响组织学，在接下来的实验中，该研究将嵌合细胞混合物在由常规Cellink组成的2LSs中，在基础培养基中添加或不添加视黄醇，培养6周，试图克服1LSs初级TOs中观察到的减数分裂阻滞（图4A）。与1ls的原始TOs不同，2ls的早期聚集体并没有从孔隙中生长出来形成更大的TOs，而是在第6周没有核心退化(图4E-G)。具体来说，嵌合的TOs包括两个不同的室室，由间质间质间质和小管周围肌样细胞或小管支持细胞组成(图4H-J)，由管壁隔开(图4E-F)。

在这项研究中，3D打印的大孔作为睾丸细胞可以生长的区域的边界，以优化睾丸细胞的形态和组织学。大的类器官大小可能限制了生存因子的扩散，导致其TOs中心部分出现退变迹象。尽管在器官培养中没有必要实现IVS，但在未来的TO实验中，从第12天开始，促性腺激素可以刺激间质细胞的类固醇生成活性，以获得先前显示的强睾酮水平。

与保留结构的睾丸器官培养相反，在TO培养的最初几天内缺乏ssc的生态位可能会引发生殖细胞凋亡。这进一步表明，在细胞重组的最初几周，培养基必须优化以增强生殖细胞的维持。除了评估TOs支持原代生殖细胞的能力外.总之，该文章报道了具有分区结构的TOs的形成，支持早期生殖细胞的长期存活和减数分裂进入。尽管取得了这一进展，但在从所述TOs中的原代生殖细胞和GS细胞获得完全精子发生之前，培养基还需要进一步优化。在TO培养物中操纵多种细胞类型的机会将加速我们对睾丸发育和功能的理解，同时也使睾丸疾病和癌症模型的产生成为可能。最后，使用TOs作为药物筛选模型将减少用于高要求生殖毒性研究的动物数量。

文案：冯天意｜排版：沈巍豪

文献原文：10.3389/fphys.2021.757565

文献链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35002756/

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