《Advanced Science》：针对多形性胶质母细胞瘤（GBM）和脑转移患者新的治疗策略

GBM作为常见且致命的癌种之一，生存期短且治疗方案存在局限性。血管周围生态位(PVN)提供了一个支持GBM进展的微环境，但它在GBM增殖和化疗耐药中的明确作用仍未被充分探索。因此急需合适的模型对此进行充分研究。动物模型价格高昂且耗时；2D培养缺乏3D血管系统的结构，使得PVN中各种细胞的空间组织变得困难。3D工程模型不仅可以捕获血管周围生态位的多细胞环境，还可以捕获微血管网络中GBM肿瘤细胞的空间组织。已有的研究表明内皮细胞和基质细胞可以在水凝胶内自组装成网络。因此，作者构建了一个3D工程脑血管周围生态位模型，以用于研究血管周围基质细胞对GBM肿瘤细胞的作用。

GelMA水凝胶中人脑血管细胞微血管网络的自组装

作者单独培养人脑微血管内皮细胞(EC)或与人脑周细胞(PC)和星形胶质细胞(AC)联合培养，以评估血管周围基质细胞在GelMA水凝胶中微血管网络形成中的作用。可以看到人脑微血管内皮细胞能够自组装成原始网络，免疫荧光证实不同组别的细胞都能产生稳定的微血管网络自组装。接下来作者又对不同组别下微血管网络形成的指标进行了分析,量化结果显示不同组别的分支点或血管的数量没有显著差异。但在加入PC及AC后，微血管网络总长度、平均分支长度显著增加且PC位于微血管网络的血管周围，AC显示出与微血管网络接触或相互作用的点状区域。

血管周围基质细胞的存在调节微血管网络的基因表达谱

在确定可以在GelMA水凝胶中形成脑微血管网络之后，研究人员又检查了这些微血管网络是否再现了体内脑微血管系统的其他特征；免疫荧光染色证实了微血管网络附近的层粘连蛋白在血管周围沉积，RT-PCR比较与紧密连接、基底膜和葡萄糖转运体相关的基因表达如：TJP-1（编码ZO-1蛋白），SLC2A1（编码转运蛋白GLUT1）；这些基因表达是成熟微血管网络的关键组成部分。接下来，作者又研究了血管周围基质细胞在GBM细胞行为的作用；通过量化外生区域来评估不同组别下GBM6球体侵袭，外生区域是入侵肿瘤细胞最外层包围的区域。结果显示将血管周围基质细胞掺入血管周围生态位模型显著增加了肿瘤细胞的侵袭数量和侵袭距离。

内皮细胞和血管周围基质细胞的联合存在增强了GBM6的侵袭

之后，作者对此进行了进一步的研究。从第3天开始，与不含血管细胞的水凝胶相比，含有最复杂微血管网络(EC:PC:AC)的水凝胶中的球体表现出明显更大的生长面积。到第5天，与仅使用gbm6的对照组相比，较不复杂的微血管网络(EC:PC)中的球体也显示出明显更大的生长区域。但单独存在ECs的GBM6细胞没有明显的侵袭优势。为了定量比较实验组之间的径向分布概况，作者将Ri指标定义为存在最大强度i%的半径。例如，R25是周长的25%被GBM细胞占据的半径。比较两组间的Ri值反映了肿瘤细胞亚群在远离球体中心迁移时侵袭能力的差异。EC:PC和EC:PC:AC水凝胶的r25、r50、r75值最高，均显著高于EC水凝胶。而对不同组别中GBM6球体的分泌谱，也确定了GBM6侵袭的潜在旁分泌介质。

内皮细胞和血管周围基质细胞的联合存在调节SOX2的表达和GBM6细胞的增殖

在确定了周细胞和星形胶质细胞在GBM6侵袭血管周围生态位中的作用后，作者推测血管周围基质细胞可能影响GBM6细胞行为的其他方面，如增殖能力和干细胞标记物的维持；因此检测了用于识别具有干细胞样行为的肿瘤细胞的多能性标志物SOX2的表达，以及KI67的表达和EdU的掺入，它们共同提供了有关肿瘤细胞循环或增殖状态的信息。为了更清楚地研究PVN信号在GBM6细胞中的作用，在微血管网络(ECs, EC:PC或EC:PC:AC网络)中封装了GBM6标本(2.5 × 105 mL-1)的单细胞分布，而不是细胞球体；具体来说，血管周围基质细胞的存在显著增加了微血管网络50 μm（定义为血管周围生态位环境）内肿瘤细胞的数量。SOX2+及Ki67+肿瘤细胞更靠近微血管网络，EdU+肿瘤细胞同样有更靠近微血管网络的趋势，但这种影响仅在只含有内皮细胞的培养中才显著。也就是说，由内皮细胞和血管周围基质细胞组成的血管周围生态位环境的信号以环境和位置依赖的方式强烈影响GBM6细胞的静止、增殖和SOX2表达的保留模式。

内皮细胞和血管周围基质细胞调节替莫唑胺治疗后的治疗反应

由于血管周围生态位与化疗耐药有关，作者又研究了替莫唑胺治疗后内皮细胞和血管周围基质细胞对GBM肿瘤细胞表型的贡献。并选择了对TMZ更为敏感的患者来源的异种移植物GBM12细胞进行研究，在水凝胶中单独培养GBM12细胞的单细胞悬液，或者在一系列越来越复杂的血管周围模型(EC, EC:PC, EC:PC:AC)中培养；GBM12-RFP的cPARP的测定检测细胞凋亡；在DMSO对照组中，与单独的内皮细胞相比，含有周细胞和星形细胞的水凝胶中凋亡的肿瘤细胞数量减少；在TMZ处理下，观察到与DMSO对照组相比，所有实验组的cPARP+(裂解PARP)凋亡细胞增加。对cPARP+和cPARP -肿瘤细胞的空间分析显示，在所有组中，大部分凋亡肿瘤细胞位于微血管网络附近。作者认为这一靠近微血管网络的增殖性肿瘤细胞亚群可能更容易受到化疗的影响，然而，作者还发现，随着血管周围基质细胞的存在，位于微血管网络附近(<10 μm)或血管周围微环境内(<50 μm)的cPARP -肿瘤细胞的比例增加。因此，血管周围环境可能提供不同的线索。在所有使用替莫唑胺的实验组中，替莫唑胺处理后KI67的表达均有所增加，且不同组别中KI67+细胞比例在统计学上相似。KI67表达的增加可能表明细胞周期动力学延长或TMZ无法阻止肿瘤细胞亚群进入细胞周期。最后，作为治疗反应的综合指标，计算了每个实验组的cPARP+/KI67+(凋亡与增殖)比率。在替莫唑胺处理下，仅gbm12培养物的cPARP+/KI67+比率显著增加，但在单独纳入内皮细胞或与血管周围基质细胞一起纳入的水凝胶中未观察到显著变化。也就是说，血管周围生态位在调节TMZ反应中的作用是复杂和不均匀的:虽然血管周围基质细胞的存在增强了替莫唑胺对肿瘤细胞周期的作用，但内皮细胞可能提供保护肿瘤细胞免于凋亡的信号。

本文转载自公众号：本草墨源

文案：胡敏｜排版：高怡

文献原文：10.1002/advs.202201888

文献链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202201888

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