《Biomaterials》：一种新型体外三层梯度系统生成睾丸类器官

瑞典，斯德哥尔摩NORDFERTIL研究实验室的Joao Pedro Alves-Lopes等人开发并表征了一种新的三维多层模型(3-LGS)，即三层梯度系统。该模型允许产生具有功能性血睾丸屏障(BTB)和生殖细胞建立和增殖的大鼠睾丸类器官。该模型在细胞组织的形成方面更接近地代表了体内的体外生殖细胞与体细胞的关联。此外，该团队还验证了维甲酸（RA）、IL-1a、TNFa和RA抑制剂在体外生殖细胞维持和BTB组织中的作用。

睾丸在雄性生物中有两个主要作用:产生配子和合成雄激素。精小管由生殖细胞分化所需的支持细胞形成的内部上皮和被称为小管周围细胞的平滑肌样细胞层组成。邻近的支持细胞之间的大腿连接网络(由闭塞带-1/紧密连接蛋白1 (Zo-1/ TJP1)和闭塞蛋白组成)形成血睾丸屏障(BTB)，并将基室(BTB下方)和腔室(BTB上方)的精管分隔开。此外，精小管由间质组织支撑，提供氧气、营养和重要的旁分泌和内分泌激素。

 在过去的几十年里，人们一直在尝试一种体外系统来模拟睾丸微环境。最早应用的方法之一是使用标准培养皿在单层饲养细胞上以二维方式进行生殖细胞培养或共培养。虽然生殖细胞是与饲养细胞(如Sertoli细胞)密切接触共同培养的，但体内的三维组织似乎对生殖细胞在体外的增殖和分化至关重要。这些观察结果促使研究人员探索3D培养方法，以便在体外密切模拟睾丸微环境。以前的模型都没有提供一个完全受控的体外平台来跟踪和影响睾丸发育和精子发生。因此，一个允许复制睾丸器官发生和功能的模型是非常必要的。该模型代表了一个新的平台，可以在体外探索新因素的作用以及不同睾丸体细胞在SSC生态位中的重要性。

3-LGS作为睾丸类器官模型的发展、表征和验证概述

为了找到最佳的细胞浓度，该团队测定了550、1100、2200、4400和8800万个细胞/mL的浓度；尽管使用的所有浓度都会导致球管结构(STSs)的形成，但该团队在以后的实验中采用4400万细胞/mL，在这个浓度下，STSs分布在菌落的中心，并且相互连接，便于进一步处理（图2A、B)。

为了检测不同睾丸成熟阶段(5-8, 20和60 dpp大鼠，分别覆盖青春期前，青春期和青春期后)的集落组织差异，在3-LGS条件下以不同浓度培养细胞。（图2C)。如前所述，20 dpp大鼠在所有浓度下均观察到STSs。对于5e8-dpp大鼠，仅在低细胞浓度下形成STSs。相反，当使用高细胞浓度时，未观察到。

本研究观察了5-8、20和60 dpp大鼠睾丸细胞的迁移情况，以进一步探索这些不同成熟阶段的组织差异。最后结果表明，与20-dpp细胞相比，5e8-dpp大鼠睾丸细胞迁移速度更快，但形成的STS集群不太紧凑，而60-dpp大鼠睾丸细胞没有表现出积极的迁移能力或STS形成。

 睾丸类器官的产生与细胞成熟期的依赖关系

20 dpp大鼠的支持细胞在培养7天后显示出自组织成STSs的能力。通过DAPI反染色，还可以在STSs之间或表面上发现其他类型的细胞（图3A)。通过PAS染色以及对Sox9和a-Sm的免疫荧光染色，20-dpp大鼠的支持细胞表现出与体内相似的排列，但小管周围细胞并没有像在体内精小管中观察到的那样，完全参与到3-LGS中的STSs中(图3A和B)。0.4% Evans蓝染料的不渗透性(图3A)和Zo-1和occludin紧密连接蛋白的表达也证明了STSs中存在功能性BTB(图3B)。

大鼠睾丸类器官特征:BTB的形成和生殖细胞的建立

在对体细胞组织进行表征后，通过寻找生殖细胞(ddx4阳性细胞)的存在，进一步探索3-LGS在体外产生睾丸类器官的潜力。这些细胞在培养21天的20 dpp大鼠细胞形成的STSs上被鉴定出来(图3C、4A）。此外，发现未分化的生殖细胞形成由细胞质桥连接的细胞链(图3C、4A)在培养中持续21天（图4 B)。此外，在培养开始后10天和21天，在类器官上观察到未分化的生殖细胞增殖(图3C)。在培养10和21天的生殖细胞中也观察到有丝分裂的图像。（图5A和B)，证实了这些细胞的增殖状态。

类风湿性关节炎在睾丸类器官生殖细胞维持中的作用

为了研究RA在类器官生殖细胞维持中的作用，作者用3-LGS将20 dpp的睾丸细胞与RA、er50891 (RXRs拮抗剂)和hx531 (RXRs拮抗剂)一起培养10天。RA 导致生殖细胞维持增加，而ER 50891处理与对照组相比降低了生殖细胞维持(图4B)。在ER 50891处理中，观察到生殖细胞维持与抑制剂的摩尔浓度成反比关系。

IL-1a和TNF影响类器官形成和生殖细胞维持

为了探索特异性促炎因子(已知在体内睾丸中有活性)对睾丸类器官生成的影响，作者使用3-LGS将20 dpp大鼠睾丸细胞与IL-1a和TNFa培养10天。与对照组相比，1和10 ng/mL的IL-1a处理显著降低了STSs的平均面积。至于TNFa处理，当施加浓度为1 ng/mL时，形成的STSs在大小方面与对照组相比没有差异。然而，当TNFa浓度为10 ng/mL时，观察到显著的降低效应(图5)。

为了进一步显示IL-1a和TNFa对类器官形成的影响，测定了整个群体中形成的STSs所占的面积。与对照组相比，暴露于IL-1a导致STSs占据的面积显著减少，分别为1和10 ng/mL。另一方面，当使用1和10 ng/mL剂量时，TNFa处理与对照组相比，STS总面积/总菌落面积的比例没有显着差异(图5)。

通过计算生殖细胞/总细胞的比率，研究IL-1a和TNFa对生殖细胞维持的影响。IL-1a浓度为1和10 ng/mL时，与对照组相比，生殖细胞维持能力显著下降。TNFa治疗显示药物浓度与生殖细胞维持有直接关系(图5)。

IL-1a和TNFa影响BTB蛋白组织

用IL-1a 和TNFa培养20-dpp大鼠睾丸细胞7天后，免疫组化检测Zo-1和occludin紧密连接蛋白的存在。与对照组相比，IL-1a治疗导致occludin缺失和Zo-1分布模式中断，其中检测到两种蛋白的明确网络。对于TNFa治疗，Zo-1和occludin的存在和分布不像IL-1a那样受到影响，但它们不像对照组中观察到的那样均匀(图6)。

IL-1a处理影响类器官的STS组织和生殖细胞维持

为了了解睾丸类器官是否不仅可以用于研究实验因素对STS形成和生殖细胞建立的影响，还可以用于研究它们对形成的STS和建立的生殖细胞的影响，作者在培养形成睾丸类器官，然后用IL-1a处理。在对照条件下培养7天后，再添加IL-1a 7天。实验结束时，7个cont/7个IL-1a STSs比对照组培养7天和14天的样品小。证实了IL-1a在STS产生方面的不可逆的负面作用(图6 /B、7）。在7个IL-1a/7cont条件下，STSs所占的面积与7个IL-1a和14个IL-1a条件下的面积相同，这表明IL-1a处理后，Sertoli细胞进一步形成和增加STSs所占面积的能力受损(图7)。

该技术与传统3D模型中常用的技术不同，传统3D模型中细胞均匀分布在支撑支架中。该团队在这里使用了一种分层系统，增加了有细胞层和无细胞层之间的表面积。这种方法增加了层间因子交换的面积，细胞可以在其中重组为STSs(图8)。这种层系统还允许使用更大的细胞悬液体积，从而产生更大的类器官。作者认为系统中类器官结构的形成是由层间产生的浓度梯度支持的:细胞代谢物在有细胞的层中更集中，因此它们向没有细胞的层扩散，最终扩散到培养基中，而存在于基质和培养基中的因子(被细胞迅速消耗)将从没有细胞的层扩散到有细胞的层(图8)。细胞代谢物的浓度会降低，基质和培养基中存在的因子比细胞层中心更有效。两个浓度梯度(细胞产物的流出和基质中存在的因子的流入)允许在层间区域形成STS(图8)。支持这一假设的是，当在单层基质中施加相同的细胞浓度(传统的3D方法)时，不会形成STS，强调了浓度梯度和3-LGS中周围层提供的自由空间的重要性。

在本研究中，3-LGS允许大鼠睾丸原代细胞形成类器官，以一种强大而有效的方式，提供了一个新的平台来探索体外的生殖-体细胞关联。该系统代表了一个创新的平台，可以在体外研究SSC生态位的不同方面。3-LGS生成的类器官与体内观察到的胚芽和支持细胞组织相似：支持细胞在培养7天内自行组织成STSs并显示上皮形成。另一方面，小管周围细胞在体内并没有像在精管周围那样完全围绕STSs进行重组，这可能与这些细胞的间充质细胞特性有关。

这些结果表明在生成的类器官中存在功能性BTB。在研究中，在STSs上也检测到未分化的生殖细胞的细胞链。作者们在培养21天后，剩余的未分化生殖细胞仍在增殖，这表明通过添加或抑制感兴趣的因素，改善培养条件可能有助于维持这些细胞在培养中更长的时间，并有助于寻找涉及生殖细胞增殖的新因素。

总之，3-LGS支持大鼠睾丸类器官的产生，代表了一种体外重组半受精样结构的新方法。此外，该团队的模型使能够验证RA和促炎细胞因子IL-1a和TNFa在BTB形成和生殖细胞维持中的作用。结果与之前体内研究的相似之处验证了使用睾丸类器官来探索睾丸生物学和体外SSC生态位的不同方面。

尽管研究中没有使用基本条件检测到精子发生的高级步骤，但未来利用仍然未知的生殖细胞分化因素可能会提高该模型的精子发生效率。事实上，起点是一个单细胞悬浮液，这将带来基因修改的机会，包括或排除(通过分选)感兴趣的细胞群。先前对构成类器官的细胞的操作可能使我们能够设计实验条件，以寻找参与调节SSC生态位和睾丸发育的基本因素和体细胞。此外，3-LGS可用于组织多能干细胞和睾丸体细胞分化为睾丸类器官，并在其他组织工程环境中改善或支持器官样结构的形成。

文案：张天意｜排版：沈巍豪

DOI:10.1016/j.biomaterials.2017.03.025

文献链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961217301692?via%3Dihub

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