《Cell》：膀胱癌类器官

来自哥伦比亚大学医学中心Michael M Shen团队的Suk Hyung Lee等人描述了一个源自于患者的膀胱癌类器官的生物库，该系列重现了人类膀胱癌的组织病理学和分子多样性。类器官系可以高效地从患者活检中建立，不论是在疾病复发前还是复发后，并且都可以与原位异种移植瘤互相转换。类器官通常保留了亲本肿瘤的异质性，并表现出一系列的基因组变化。这些变化与肿瘤在培养中的演变一致。使用膀胱肿瘤类器官分析药物反应，可以显示出与突变谱的部分相关性，以及与治疗抗性相关的变化，并且特定的反应可以使用体内异种移植进行验证。作者的研究表明，根据患者肿瘤组织制造出的膀胱肿瘤类器官，在用于研究肿瘤演变和癌症精准医学的药效评价中，是一个可靠的模型系统。

膀胱癌是美国第五大常见的癌症，但尚缺乏能够准确反映人类疾病生物学的实验模型。大多数膀胱癌是尿路上皮癌，其中大部分是非肌层浸润性的膀胱癌。对这类癌症通常可以有相对较好的对病情的预测（预后），但也伴随着相当高的发病率和管理治疗费用。相比之下，肌肉浸润性膀胱癌的预后相对较差。膀胱癌的治疗方案及其疗效因临床分期和相关风险因素而异。对于肌层浸润性膀胱癌，目前的护理标准是以顺铂为基础的新辅助化疗，然后进行根治性膀胱切除术。虽然约有50%的膀胱切除术患者在5年后仍然存活，但该手术影响了生活质量，因此许多患者无法接受。因此，开发非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌的模型有重要意义，以阐明复发性体细胞突变的生物学功能及其在介导转化和促进疾病的作用，以此来制定合理治疗策略。

图1：源于患者的膀胱肿瘤器官和异种移植的建立

作者使用新鲜的的患者TUR样本建立了膀胱癌类器官，范围从低级别非肌层浸润性疾病到高级别肌层浸润性癌症。肿瘤组织直接从膀胱镜检查室或手术室运送到实验室进行处理，在那里将它们分成若干块用于类器官培养，以及用于分析亲本肿瘤（图1A）。使用这种方法，作者已经制造出了独立的膀胱肿瘤类器官（SCBO-1-SCBO-16），对应于16个不同的病人。部分类器官在3-5次传代后未能继续增殖；根据其有限的特征，无法确定这些失败的类器官有明显的共同特征。相比之下，成功建立的类器官已经连续传代多达26个传代，并经过冷冻保存和恢复，其增殖能力没有任何明显的减弱。在培养过程中，类器官显示出从球状到不对称的形态，类器官及它们相应的亲本肿瘤组织病理学特征显示出高度的一致性（图1B）；在连续传代过程中从未观察到良性组织的存在。

为了在培养和适当的组织微环境中对患者来源的膀胱肿瘤样本进行分析，作者开发了一种优化的方法，将膀胱肿瘤类器官转化为免疫缺陷小鼠的原位异种移植，效率很高（83%）（图1C），使用超声引导将细胞植入膀胱尿道上皮和固有层/肌肉层之间。原位异种细胞的组织学分析，移植的组织学分析，以及从这些异种移植中得到的器官，表明它们与原始亲本肿瘤的相似性（图1B）。

图2：膀胱类器官的分子改变

为了确定体细胞突变以及DNA拷贝数的改变，并探索模型的基因组代表性，作者使用MSK-IMPACT平台进行了定向测序。这些分析在源于患者的类器官中发现了许多基因组改变，包括推定的致癌驱动因素的点突变，以及拷贝数的改变（图2A）。此外，比较类器官和其相应的亲本肿瘤显示，它们的突变谱是高度一致的，分析的11个系显示出大于80%的一致性，只有4个系显示出小于60%的一致性（图2B）。作者还检测到人类膀胱癌特有的不太常见的驱动突变，如STAG2、ERBB2和EGFR的改变（图2A）。鉴于这一罕见事件在膀胱癌中的潜在生物学意义，作者通过PCR扩增和测序验证了这种基因融合的存在，确定了FGFR3的第17外显子和TACC3的第11外显子之间的融合（图2C）。

图3：在类器官培养和异体移植建立过程中的肿瘤演变

在大多数情况下，相同来源的样本之间的突变谱是相似的，表明肿瘤基因型在很大程度上得到了保持。然而，作者观察到，在培养的连续传代过程中和/或在移植或从移植物中重新建立器官的过程中，有一个突变的子集被丢失或获得（图3A）。在分析每个品系的克隆组成时，作者发现主干突变被保留，但亚克隆突变可能被获得或丢失（图3B）。许多类器官在连续传代以及随后的异种移植和/或重新建立类器官培养过程中显示出克隆性进化。作者还利用外显子组测序来推断潜在突变过程的特征（图3C）。尽管在连续传代和异种移植过程中不断进行克隆进化，这些突变特征似乎是稳定的（图3C）。外显子测序数据的系统发育分析显示了器官、异种移植和从异种移植中建立的器官的线性和支链肿瘤进化模式（图3D）。

图4：类器官培养中的表型稳定性和可塑性

为了检查膀胱器官内的管腔和基底细胞类型，作者对每个器官类器官以及其相应的亲本肿瘤、异种移植和异种移植器官中的标记物表达进行了免疫荧光分析（图4）。作者的研究表明，大多数类器官和相应的亲本肿瘤可以被归类为腔镜或基底型，尽管有几个没有显示明确的腔镜或基底型亚型，作者认为它们是 "混合型"（图4C）。

图5.：类器官的药物反应

为了探索类器官作为评价药物反应的临床前模型的效用，作者用9个类器官研究40个化合物的影响，用11个类器官研究另外10个化合物的影响（图5A）。对这些化合物的反应显示了类器官之间高度的相似性和差异性，以及与它们的突变谱的部分相关性（图5A）。 作者还用突变图谱来预测潜在的相加药物反应。例如，作者发现SCBO-6对FGFR抑制剂JNJ-42756493和mTOR抑制剂AZD8055的治疗显示出相加反应，这与TSC1中存在激活的FGFR3突变和无义突变是一致的（图5E）。作者还发现JNJ-42756493和mTOR抑制剂西罗莫司在SCBO-6中也有类似的相加作用（图5E）。

图6：原位异体移植中药物反应的体内验证

最后，作者试图通过体内原位异种移植的治疗来验证类器官培养中确定的药物反应。为此，作者检查了三种药物和类器官的组合，对应于曲美替尼治疗对SCBO-6和SCBO-3的影响，以及吉西他滨对SCBO-5的影响，每种药物在类器官培养中都显示出反应（图6A）。在超声成像的纵向评估中，作者观察到每种药物对肿瘤大小的显著影响（图6B-6H）。作者还发现肿瘤组织学的变化和曲美替尼治疗后细胞增殖的显著下降，以及吉西他滨治疗后裂解caspase-3表达的显著增加（图6C-6H）。这些发现表明，在类器官培养中观察到的药物反应，在体内进行检测时是可以重现的。

作者的研究表明，源于患者的膀胱肿瘤类器官可以再现人类非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱癌的广泛组织病理学和分子谱。类器官的突变谱不仅具有它们所来自的亲本肿瘤的高度特征，而且还具有人类膀胱癌的整体特征。类器官和原位异种移植可以高效率地相互转换，允许每种模型在适当的时候用于其特定的实验优势，包括验证体内的药物反应。

源于患者的膀胱肿瘤器官经常保留明显的肿瘤异质性，在培养中很容易发生克隆进化。原则上，这些模式可能对应于随机的中性漂移，可能代表了培养中选择压力的结果，和/或可能反映了肿瘤亚克隆内一个或多个致癌驱动因子的活动，这些驱动因子介导了克隆竞争。未来的研究可以利用类器官培养中的直接实验操作来解决这些克隆进化的机制。

类器官的表型稳定性或不稳定性与它们的病理学、突变情况或药物反应之间没有明显的相关性。由于这些标记物的表达模式在来自这些类器官的异种移植中通常是可逆的，而且表型特性与亚克隆突变频率的变化没有明显的相关性，作者认为类器官培养中的这些表型变化可能是由于细胞的可塑性造成。这种可塑性可能是通过在类器官培养与异种移植条件下的表观遗传修饰模式的变化产生的。这种表型的可塑性可能反映了一种自然的疾病过程。观察到的基底标志物表达的增加可能再现了肿瘤向鳞状表型（表达基底标志物）分化的早期前微观阶段。此外，在膀胱肿瘤器官中观察到的管腔细胞的可塑性可能表明，管腔表型的维持往往需要一个基质微环境，这在器官培养中是缺乏的，但在异种移植中却得到了恢复。

原发性膀胱癌与大多数实体瘤不同的一个显著特点是能够从同一患者身上获得多个不同疾病状态的肿瘤样本。在许多情况下，患者在治疗前后都会进行切除手术，每次切除都提供了生成相应类器官的机会。这些来自复发性膀胱癌患者的类器官为研究原发性实体瘤的肿瘤演变和药物反应提供了一个很好的模型系统。

源于患者的类器官模型在癌症精准医学中的重要临床应用包括，将癌症突变特征的描述与治疗性化合物库的高通量筛选结合，阐明可药用的目标。就膀胱癌而言，患者往往在疾病发展的早期就被诊断出来，非肌肉浸润性癌症患者经常接受多次切除和治疗，以避免膀胱切除及其对生活质量的有害影响。因此，在类器官培养中筛选出的阳性药物反应可以在类器官衍生的异种移植中得到验证，原则上可以用来指导静脉内的治疗方法。

原文：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.017