《Science Advances》：可灌注的3D生物打印胶质母细胞瘤模型

许多药物在实验室研究中显示出很好的效果，但最终在临床试验中失败。来自Tel Aviv University的Ronit Satchi-Fainaro团队的Lena Neufeld等作者提出假设，这种转化差距的一个主要原因是目前的癌症模型是不够完备的。大多数模型缺乏肿瘤－基质的相互作用，而这种相互作用对于正确表达癌症复杂的生物学特性至关重要。因此，作者通过创建由源于患者的胶质母细胞瘤细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞组成的纤维蛋白胶质母细胞瘤生物墨水，再现了肿瘤异质微环境。此外，作者使用覆盖脑周细胞和内皮细胞的牺牲性生物墨水创建了可灌注的血管。与在刚性塑料板上的2D培养模型不同，在生物墨水平台中生长的胶质母细胞的生长曲线、药物反应和遗传特性与在正位癌小鼠模型中的类似。作者的3D生物打印模型可能成为快速、可复制和强大的靶点发现平台，有潜力取代细胞培养和动物模型，同时可以进行个性化疗法筛选和药物开发。

含有6%（w/v）明胶的细胞的纤维蛋白3D生物墨水中显示出最高的增殖率（图1D）。荧光成像以及H&E染色（图1E）显示了多样化的细胞形态，表明3D生物墨水中的GBM细胞可能与生物墨水有不同的互动，建立了每个细胞类型特有的细胞－基质互动。

图1. 生物力学特征决定了最能模仿脑组织弹性和组成的生物墨水成分

在细胞接种7天后，作者观察到在纤维蛋白生物墨水切片中表达了hAstro和hMG激活标志物（图2A）。hAstro的加入增强了源于患者的PD-GBM4细胞的生长速度，这表明hAstro分泌的因子能增强癌细胞的增殖（图2B）。充满细胞的纤维蛋白生物墨水对周围基质显示出细胞丝状体，表明存在细胞－细胞和细胞-ECM相互作用（图2D）。

图2. 3D仿脑生物墨水具有良好生物相容性，能促进GBM细胞和脑基质细胞的长期细胞存活

作者在GBM-生物墨水中设计了一个功能性的血管（图3A）。血管网络使用Pluronic F127和Th组成的逃逸性生物墨水来制造，打印在纤维蛋白生物墨水之上（图3B）。在打印的血管上再浇筑一层GBM-生物墨水后，将血管化的3D－生物打印模型密封在作者设计的金属灌注芯片中（图3C）。这些可灌注的血管提供了模拟血脑屏障（BBB）的可能性，允许在有或没有癌细胞的情况下评估内皮屏障的完整性和功能（图3F）。

图3. 纤维蛋白仿脑生物墨水与3D打印的可灌注的血管网络相结合

当在2D单层培养时，两对休眠和快速生长的细胞都显示出类似的生长速度和入侵能力，失去了在体内观察到的生长特征和差异（图4，C和D）。在3D培养时，与休眠型肿瘤的细胞相比，快速生长型肿瘤的细胞显示出明显更高的增殖率（图4E）。在第14天，T98G-快速生长细胞的侵袭比T98G-休眠细胞在纤维蛋白生物墨水中的侵袭高100倍，而U-87MG-快速生长细胞在第14天比U-87MG-休眠细胞在纤维蛋白生物墨水中的侵袭高2倍（图4F），与体内的观察一致。

图4. 纤维蛋白生物墨水再现了两种GBM人类细胞类型的休眠现象，到目前为止，这种现象只能在SCID小鼠中观察到，而不能在2D培养中看到

用SELPi处理纤维蛋白生物墨水中的细胞，对T98G细胞和U-87MG快速生长细胞类型有明显抑制，这与生物墨水中P-选择素的表达水平高于2D培养相关（图5，B和C）。

图5. SELPi处理导致纤维蛋白生物墨水中的GBM细胞增殖与2D培养相比大幅减少

PC1表明相对于2D培养的细胞，在纤维蛋白生物墨水中生长的细胞与从GBM肿瘤小鼠中分离的GBM肿瘤细胞的特征更相似。在所有富集的通路中，作者重点关注GBM相关的通路 [血管生成标志、JAK-STAT信号通路、IFN-γ相关反应、VEGF通路上调、表皮生长因子受体通路上调和转化生长因子－β信号通路] ，并评估了每个检查组中上调的基因（图6D）。

图6. RNA-seq分析显示在纤维蛋白生物墨水中生长的GL261和在小鼠中生长的GL261细胞的基因表达与在2D培养中生长的GL261相比有更高的相似性

由于大脑TME在肿瘤进展中起着至关重要的作用，本研究中作者将星形胶质细胞和小胶质细胞纳入生物墨水中，这两种细胞已被证明在GBM的进展中有作用，并构成大脑中的大多数胶质细胞。作者发现，纤维蛋白3D生物墨水支持GBM TME细胞在接种后生存长达8周。

此外，作者的3D灌注芯片允许长期流动、成像和药物反应评估。这是第一个关于可灌注的3D生物打印的GBM五细胞培养模型的研究报告，能够替代小鼠模型，模仿在体内生长的肿瘤的关键特征。迄今为止只在SCID小鼠中观察到，而在2D培养中观察不到的，人类细胞系的休眠状态，在本研究中成功重现。

与2D培养方法相比，作者的3D生物墨水可用于更准确地评估对治疗的反应。作者评估了三种源于患者的细胞对TMZ治疗的反应。结果显示，生长在3D模型中的不同的患者衍生细胞对TMZ的反应不同，而当细胞在2D模型中生长时，没有观察到对TMZ的反应差异。这表明作者的模型比传统的2D模型更好地反映了在患者身上看到的广泛的药物反应。此外，作者成功地创建了一个乳腺癌脑转移的血管化3D模型，由MDA-MB-231人类乳腺癌细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞以及使用人类内皮细胞和周细胞制备的功能性血管组成。这是作者的3D模型除了用于原位脑肿瘤外也可用于研究脑转移的概念证明。

作者对生物墨水的机械性能、细胞密度、细胞存活率以及细胞类型进行了全面的校准和优化，以实现实验方法的标准化。标准化实验方法将作为特定患者样本的起始参数。然而，由于每个患者都是独一无二的，这些参数可能需要以个性化的方式进行微调（图7）。

图7. 减少从临床到实验室再到临床的转化差距

原文出处：DOI: 10.1126/sciadv.abi9119

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