《Small》： 生物3D打印的胶质母细胞瘤模型模拟细胞外基质力学性能异质性

胶质母细胞瘤（GBM）是最致命的原发性脑肿瘤，其特点是细胞和分子的高度异质性，血管过密，以及先天的耐药。细胞成分和细胞外基质（ECM）是GBM中异质性的两个主要来源。本文中，来自加州大学圣地亚哥分校的Tariq M. Rana和Shaochen Chen团队的Min Tang等作者开发了具有肿瘤区域、无细胞ECM区域和内皮区域的仿生物三区GBM模型，其区域硬度与GBM基质、病理或正常脑实质和脑毛细血管相对应。DLP光固化生物3D打印技术的灵活性和多样化的材料选择允许对肿瘤模型的生物物理特性和生化特性进行正交调制。

源于患者的GBM细胞、人类内皮细胞和透明质酸衍生物被用来建立一个人源化的微环境。这项体外研究表明，生物物理信号参与各种肿瘤细胞行为和血管生成潜力，并调控肿瘤细胞转化为不同分子亚型。硬质模型的转录表达与间充质亚型相似，肿瘤细胞呈弥漫性侵袭，并对替莫唑胺展现更高的药物抗性，同时内皮细胞表现出出芽式血管新生形态。软质模型表现出经典亚型相关通路的富集，肿瘤细胞表现出扩张性细胞生长。本研究采用光固化生物3D打印技术，能够实现快速、灵活和可重复的具有生物物理异质性的患者特异性GBM模型，在未来的研究中可以作为一个可调控的系统来研究GBM疾病机制和筛选药物。

为了再现空间上不均匀的ECM微环境，并探究ECM异质性如何影响GBM的发展和内皮细胞的生长，作者利用DLP 3D生物打印系统和脑瘤特异性ECM衍生的生物墨水，包括GMHA和GelMA，创建四个不同的模型：纯肿瘤的硬质模型、纯肿瘤的软质模型、共培养的硬质模型和共培养的软质模型（图1A）。共培养模型中采用了人脐带血管内皮细胞（HUVECs）打印内皮区域，以包围肿瘤和ECM区域（图1B）。对ECM区域，作者设计了两种不同的硬度，以模仿GBM组织的硬度和健康大脑的硬度（图1C）。作者进一步使用这些具有不同机械性能的3D打印GBM模型，进行在生物物理信号和培养条件下的评估，包括基因表达、药物反应、肿瘤细胞迁移行为和血管生成活动。（图1E）。

图1. 3D生物打印的GBM模型具有区域性的不同生物物理特性

主成分分析显示，球状体培养与任何一种3D培养相比都有截然不同的转录谱，而两种3D培养之间的差异程度较小（图2A）。一些蛋白编码的癌症相关基因或预后基因在两种3D培养条件下都上调了16倍以上（图2B，C）。与球状体相比，与 DNA复制、细胞周期调控和细胞分裂的通路在3D软质模型中明显富集（图2D）。

与缺氧、癌症侵袭性、E-cadherin缺失引起的转移，以及对干扰素、炎症、ECM和细胞凋亡等外部刺激的反应的相关基因集在硬质模型中明显富集（图3A，B）。低氧相关的基因，以及低氧相关的血管生成标志物VEGFA和SPP1在硬质模型中都被上调（图3C）。免疫荧光（IF）染色显示，软质模型中存在更多的KI67阳性细胞（图3D）。

TS576细胞和CW468细胞在软质模型中的侵袭面积分别是硬质模型的7倍和4.4倍（图3F）。与从软质模型中分离出的TS576细胞相比，从硬质模型中分离出的TS576细胞高度富含原发性GBM组织特征（图3G），表明硬质模型将细胞转化为更具有临床意义的状态。

在硬质模型中，迁移的CD31+HUVECs表现出类似出芽的血管新生形态，并与SOX2+GBM细胞紧密接触（图4A）。血管生成标志物SPP1和VEGFA在所有的3D模型中都是上调的，并且在硬质模型或共培养模型中明显富集（图4B）。

肿瘤细胞在软质共培养模型中以类纤维细胞形态扩增，而在硬质模型中则以更圆的形态扩增（图4C）。与球状体培养的细胞相比，所有3D生物打印模型中肿瘤细胞都显示出对TMZ的耐药性增强（图4D）。qPCR分析显示，耐药性相关基因如ABCG2和CXCL12在硬质共培养条件下分别上调了8倍和24倍（图4E），与TMZ治疗反应一致。

本研究中，肿瘤区和内皮区被设计成具有类似于其原始状态的硬度。在肿瘤区和内皮区之间打印了专门设计的ECM区域的两种硬度条件，以模仿GBM重塑的基质或健康的脑实质硬度，并诱导不同的肿瘤细胞生长和行为。细胞在软质模型中迅速增殖和扩增；在硬质模型中，与恶性表型有关的缺氧、干性和血管生成能力得到加强。

肿瘤细胞在两种硬度的微环境中以不同的形态和模式侵入ECM区域。硬质模型中表现出单细胞弥漫性侵袭模式，而软质模型中则表现出扩张性生长模式。这两种侵袭模式都在GBM细胞中被观察到过，这表明硬度变化模型可能适合模拟GBM发展的不同状态。基因集富集分析表明，这两种硬度适合模拟不同的GBM亚型。

血管化是GBM的一个特征，它促进了肿瘤的生长，有利于肿瘤的侵袭。基因表达显示，硬质模型中的肿瘤细胞表达了较高的血管生成标志物，与硬质模型中观察到的出芽表型一致。软质模型促进了细胞的增殖，表现为肿瘤细胞的侵袭面积增大和内皮细胞的增殖。

对所有模型和球体培养对照的TMZ用药处理处理结果显示，硬质共培养模型的肿瘤细胞存活率最高，这表明硬质条件以及与内皮细胞的共培养增强了GBM的抗药性。

本研究中提出的三区硬度模式的GBM模型是第一个将GBM的生理相关的生物物理异质性与生化相关的ECM材料相结合的模型。区域硬度更好地再现了原生环境，并可能有利于更多的生物模拟细胞-ECM和细胞相互作用。未来可用这些模型来研究GBM的不同亚型以及GBM的不同阶段。硬度变化也可应用于未来的模型，研究生物物理对其他肿瘤-基质相互作用的影响。

原文：https://doi.org/10.1002/smll.202006050

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