《Biofabrication》：3D打印类肿瘤免疫疗法评估

近日，剑桥大学的Jacqueline D Shields和Yan Yan Shery Huang教授，基于肿瘤微环境和生物3D打印方向研究文章发表Deployable extrusion bioprinting of compartmental tumoroids with cancer associated fibroblasts for immune cell interactions于《Biofabrication》上。在这篇文章中，作者基于可部署的挤出生物打印机（BioArm），打印了具有肿瘤相关成纤维细胞的隔室类肿瘤，用于研究类肿瘤与免疫细胞的相互作用以及对免疫疗法的响应。

文章首先测试了挤出式3D打印机的打印性能。研究人员使用40% PF127进行分辨率测试，通过打印最小直径分布直方图可以看出打印机可实现的最小层次厚度约为150um；使用不同的输入幅值（范围从0.5mm到1.5mm）进行平面运动重复性测试，结果表明所有打印的正弦波形均与相应的输入参数匹配。这表明该3D生物打印机具有良好的平面运动复现性。最后为评估BioArm逐层构建3D软材料的适用性，进行空气打印立方体，测试结果可知当大于等于1 mm时，可以重复打印立方体。

其次，文章阐述了类肿瘤3D打印过程及生物墨水设计考虑。作者选择了可后续进行自组装生物墨水的配方，包括低水平明胶和海藻酸盐，明胶保证室温下生物墨水的可打印性，海藻酸盐提供培养早期阶段的临时支架。类肿瘤的打印分为两个部分，外部基质部分和内部肿瘤部分，基质部分仅用含有PanCAF细胞的生物墨水，内部肿瘤部分使用含有mM1成纤维细胞和PanCAF细胞的生物墨水。第二天进行海藻酸盐的处理，海藻酸盐未处理过的类肿瘤体积较小、形状不规则且活性差，随着海藻酸盐裂解酶处理浓度的升高，类肿瘤的体积虽然略有缩小，但可获得较均匀的球形结构，且流式细胞术结果显示，使用海藻酸盐裂解酶后细胞活性较好，并维持到了第十四天。通过Ki67﹢染色显示，与仅存在肿瘤细胞的对照组相比，类肿瘤中CAF对肿瘤生长具有促进作用。

随后，作者表征了3D打印类器官的肿瘤微环境，共聚焦成像显示类器官呈现出清晰的核-壳结构，且能观察到明确的包膜和网络状结构，并且类肿瘤中能明显检测出ECM成分沉积，例如胶原 I（红色）、骨桥蛋白（白色）和基底膜蛋白聚糖（绿色），其分布与富含CAF的外壳一致。整个核心都可见网络状结构，类似于体内肿瘤边缘和中心看到的现象。并且能明确观察到核心内存在用CA9染成绿色的缺氧区域，并且还与CAF壳并列，表明该类肿瘤概括了关键的CAF功能特征。鉴于CAF的异质性，作者利用流式细胞术比较了2D、3D、体内不同培养条件下CAF的激活情况。作者先用鬼臼蛋白确定CAF的存在，并用CD34和αSMA对CAF进行了分群，结果显示，在2D情况下，CAF 主要表达 αSMA，且几乎检测不到CD34阳性群体。相比而言，类肿瘤中的CAF群体更接近体内状态。因此，在类肿瘤中产生的体外环境更能够从长期培养的细胞中诱导出更多样的 CAF 重排，是研究肿瘤内发生的事件和相互作用的有利平台。

为了进一步模拟体内情况，作者将混合的脾细胞群分散在胶原凝胶中，并嵌入了第5天3D打印的类肿瘤。利用流式细胞术和共聚焦，证实了浸润性 T 细胞、NK 和 CD11b 细胞的存在。与体内相比，类肿瘤中CD11b阳性细胞所占数量较少但其他细胞较多，可能与体外补充的脾细胞群中富含B细胞有关，但T细胞均为最主要的细胞群之一。CAF细胞的加入并未明显影响免疫细胞活性，但存在支持先天免疫细胞浸润的现象（ CD11b和CD11c ），并且能观察到更多增殖的CD11b细胞。并且能够看出添加到肿瘤细胞中的免疫群体会渗透进类肿瘤中，与的体内情况一致，且看出类肿瘤中添加脾细胞后，类肿瘤活性降低，但脾细胞依旧存活，说明了免疫细胞与类肿瘤间的相互作用。

最后，作者运用此模型评价了免疫疗法，切片扫描快照显示，与IgG对照治疗的条件相比免疫疗法刺激的免疫细胞能快速募集到 3D 打印的类肿瘤中。对视频中捕获的细胞迁移进行定量，免疫疗法刺激的免疫细胞平均移动速度和最大移动速度均明显快于对照组并且通过位移测量的距离更远，表明与IgG对照治疗的条件相比，免疫疗法治疗组的归巢路径更直接。对免疫细胞相对于肿瘤中心的位移的进一步分析，结果显示免疫疗法刺激的免疫细胞对肿瘤的定向性增加。方向性热图显示，IgG 对照中1400min后在距类肿瘤中心 900-1000 μm 之间仍有高密度细胞。在存在抗CTLA4的情况下，在 400 到 600 分钟之间，在距离中心约 700 μm 处就能观察到相当大比例的细胞。超过这个时间点，细胞位移变得更加随机分布。考虑到类肿瘤的半径约为 700 μm，这种方向性的丧失可能是免疫细胞到达类肿瘤表面的结果，在那里细胞可能会将其行为从定向迁移转变为浸润肿瘤组织

文章建立了一种通用方法，为 CAF 重新获得类似于体内的表型提供了有利条件，并且将其应用于免疫疗法的评价。

本文作者：赵培媛、排版：高怡

转载自公众号：本草墨源

原文：10.1088/1758-5090/acb1db.

文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36626838/

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