《ACA Nano》：微针通过机械通路直接下调疤痕形成

增生性瘢痕（HSs）是一种影响70%创伤后患者的病理性瘢痕，其通常表现为异常僵硬隆起、拉伸强度降低和色素沉着障碍等。HS会引起患者瘙痒、慢性疼痛、肢体活动能力丧失以及焦虑和抑郁，因此仍然是创伤后伤口管理的重大挑战。在这一过程中，过度的细胞外基质沉积驱使成纤维细胞进入高机械应力状态，从而加剧病理性纤维化和增生性瘢痕的形成，导致组织功能障碍。

有鉴于此，陆军军医大学罗高兴教授、谭江琳副主任医师和加拿大曼尼托巴大学Malcolm Xing副教授等人报告了一种丝素蛋白微针贴片（SF MNs），可通过微创的方法实现无瘢痕组织。研究显示，仅通过调整微针的大小和密度，生物相容性微针就可显著降低兔耳增生性瘢痕模型中的瘢痕隆起指数（scar elevation index, SEI），并增加极限拉伸强度以接近正常皮肤。为了进一步理解这一现象，研究还建立了成纤维细胞-胶原网系统和有限元模型来研究微针介导的成纤维细胞的细胞行为。相关基因分析表明，微针治疗模型的力学敏感基因ANKRD1的表达减少，意味着微针能够减少成纤维细胞产生的收缩和机械应力，从而有助于显著减少瘢痕的形成。因此，微针通过机械疗法策略进行物理干预有望实现无瘢痕伤口愈合。相关工作以“Down-Regulating Scar Formation by Microneedles Directly via a Mechanical Communication Pathway”为题发表在ACS Nano。

然而，目前的手术干预、压力衣、激光疗法和按摩等高度依赖于临床医生的技能，且存在不同程度的不良反应。到目前为止，仍然缺乏一种侵入性较小、方便有效的 HSs 的机械疗法。微针 （MNs） 固有的无痛性和极小的侵入性，为实现皮下物质交换提供了强大的工具。然而，其本身的治疗效果常被忽视。

基于此，作者提出：利用微针直接物理干预成纤维细胞与ECM之间的机械力交互作用，以降低成纤维细胞的机械力应激反应，下调纤维化相关细胞因子和蛋白的表达水平，或许是一种有效治疗增生性瘢痕的新途径。为了验证这一假设，作者研究了聚合物微针重塑增生性疤痕的作用及其机制，并探索了潜在的机械转导机制。

1. 微针设计与制造

2. 病理指标测定，探究聚合物微针阵列密度和三维尺度对瘢痕治疗效果的影响规律

3. 模型建立，以显示成纤维细胞在微针干预下产生的收缩和 ECM 的机械力微环境的变化

4. 转录组测序，筛选出分子信号转导通路

5. 验证相关显著差异蛋白的表达，进一步明确微针直接通过机械力学信号传导调节成纤维细胞的作用与机制。

作者采用两步模板法制备 SF MN 贴片，4℃ 凝胶化后，固态的SF在充满甲醇的真空烘箱中干燥过夜，以获得高含量的β-折叠二级结构，这有助于提高SF MNs的机械强度。柔性背衬层选择的材料是PVA。微针阵列为15×15贴片，金字塔形，底部边长为300μm，针长1000μm。

为了调节针头和组织之间的机械相互作用，作者设计了 2300、1070 和 690 μm 三种针距，液态胶原液滴的接触角变化表明，MNs的阵列密度可以导致表面能的变化。疏水性随着微针密度的增加而增加。从力学角度来看，增加针头密度会诱导更多的渗透物到疤痕组织中，增强对细胞定向迁移和生长引起的变形的抵抗力。从物理角度来看，较大的针密度会导致斑块的接触角或疏水性升高，另一方面，这也可能限制细胞迁移和增殖，导致成纤维细胞在疤痕组织中产生的收缩应力降低。

微针脱模后进行甲醇气浴，可以实现对瘢痕组织的高效渗透和物理相互作用，促进SF分子的二级结构从无规卷曲向β片构象转变，增强微针的结晶度和断裂强度。通过对红外光谱中各峰进行归属和定量，证实了气浴后β片二级结构含量的升高。气浴后微针机械强度的提高。此外，甲醇气浴还降低了微针的溶胀性，24h内的溶胀率从74.8%下降到21.8%

作者使用光学显微镜和扫描电镜（SEM）观察了微针贴片在使用前和刺入后第3、7、20和30天的2D图像，发现MN在穿透前后都显示出完整的结构。为了量化降解效率，作者对贴片进行3D扫描和重建，以统计分析单个残余微针的体积。结果长达 30 天的持续时间可以保证对治疗进行充分的物理干预。即使在30天后，降解率也没有超过50%，表明该法可控地延长了微针的降解、丝素蛋白和PVA表现出优异的细胞和生物相容性。

作者在研究中采用兔耳模型，每周测量部分疤痕的最大厚度。一个月后，收获HSs组织以测量硬度和颜色变化，用于生物力学测试以及组织学和生化分析。

治疗一个月后，疤痕的总体外观明显改善。

此外，MNs 诱导的物理干预导致红斑颜色显著改善、厚度减少，以及疤痕硬度降低。

由于机械力和应力是推动伤口愈合过程中 HS 生成的关键触发因素。作者对哑铃形未受伤皮肤和疤痕进行了单轴应力松弛试验和拉伸失效试验，未处理的疤痕组织在10%的伸长应变下产生的力（8.02±2.14 N）大于正常皮肤（4.26±0.22 N），表明瘢痕组织对给定的伸展表现出更僵硬的反应。

在应力松弛试验中，根据图（Ⅰ）伸长-松弛数据，作者计算出图（Ⅱ）峰值松弛载荷和松弛速率：在松弛过程中，未经处理的瘢痕组织单位时间内的应力减少量高于正常皮肤。

作者进一步进行了拉伸测试，以研究针头在疤痕形成过程中对组织刚度和强度的影响。测试了极限拉伸强度，以表明组织抵抗外部应力的能力。

最终结果表明，HS 的极限强度和最大延展性的提高表明 MN 干预有助于恢复受伤皮肤的韧性和柔韧性。

除了表观形貌和力学性能外，作者还通过研究HS组织的病理特征，包括ECM过度沉积、细胞增加和慢性炎症，进一步评估了SF MNs的治疗效果。

显示了瘢痕组织和正常皮肤切片的H&E、Masson和天狼星红染色图像：与正常组织相比，未经处理的HS明显隆起，胶原过度沉积、错位，真皮厚度超过2 mm，SF MNs处理后HS中胶原纤维的密度减少、排列趋于整齐。

从图像定量SEI（即瘢痕高度）、细胞密度以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原的比率：

① SEI与HS的形成呈正相关，未经处理的HS的SEI值为4.99，SF MNs处理后的SEI值为1.45；

② 未处理的HS细胞密度最高，SF MNs处理后HS细胞数随MN密度的增加而逐渐减少；

③ 正常皮肤Ⅰ型和Ⅲ型胶原的比率约为1: 1，未经处理的HS约为5.18: 1，而 SF MNs有效抑制了Ⅰ型胶原沉积。

Western blot 分析不同MNs处理后 HS中TGF-β1和α-SMA的表达，结果显示，MNs处理后，TGF-β1和α-SMA的蛋白水平显著降低。

综上表明 SF MN 对 HS 治疗具有显著疗效。

为了解SF MN贴片对 HSs 的潜在机制，作者构建了胶原晶格系统（FPCL），通过模拟人HS来源的成纤维细胞 （HSF） 的收缩来研究 SF MN 带来的影响。简言之，就是将Cy-7标记的SF MN包埋在胶原基质中，并与成纤维细胞共培养。

成纤维细胞产生的收缩会迫使胶原基质变形，而SF MNs可以有效抑制这一变形；收缩指数（CI）用于表征基质收缩的速率和程度。CI 随着MN密度的增加而下降；流变分析表明，随着SF MNs的干预，胶原基质的储存模量也发生了显著变化。

为了更深入地了解MN是否诱导胶原基质中的生物力学转变，作者基于胶原变形的实验数据建立了一个有限元模型，以数值计算胶原晶格中响应 SF MN 干预的应力分布，模拟SF MNs对胶原基质的机械冲击。

模拟CI与实际CI接近，表明该模型与实际FPCL模型完全吻合；图5G和H分别展示了三维和截面轮廓的应力，在未治疗组收缩期间，机械应力往往集中在基质中心。而MN干预导致压力分散，机械应力水平也降低。较高的机械应力往往集中在针尖区域，可能是由于阵列密度过大引起的空间压缩，对胶原基质产生显著压力并增加局部接触部位的压力。这些结果表明，嵌入的MNs阻碍了胶原基质的收缩，干扰了胶原基质介导的机械通讯，从而减少了成纤维细胞产生的收缩力。

还研究了与机械转导信号通路相关的细胞因子和蛋白质的表达。TGF-β1、α-SMA和机械敏感基因ANKRD1表达显著下调，表明由于SF MNs的干预，成纤维细胞感受到了来自周围微环境的较弱的机械力。

为了阐明与SF MN干预阻断机械通讯相关的转录组变化，作者采用了RNA测序。图6C热图和D下调基因的定量统计表明，在SF MNs处理后，与机械转导相关的多个基因（ANKRD1、ITG β/α和ROCK1）以及和瘢痕形成相关基因（COL1A1、COL3A1、HIF-1α、CTGF和FN1）下调。对下调基因进行KEGG富集分析显示，下调的基因显著参与细胞外基质黏附途径，减少机械转导和细胞外基质沉积。

蛋白质互作网络分析发现，细胞外基质（包括COL1A1、COL3A1、COL6A3、COL11A1、FBN1和FN1）的沉积与细胞间、细胞间基质（ITG β/α、THBS1、ANKRD1、POSTN和ROCK1）的机械通讯密切相关。随后发生了一系列信号转导事件，涉及纤维化相关基因表达的调节，包括CTGF，IGF2和HIF1A。

这些结果表明，SF MNs通过弱化环境中的机械应力触发了瘢痕形成的级联负调控。

整合素/FAK 介导的机械转导通路参与 HSs 中机械信号的转导和成纤维细胞的激活。因此，作者提出SF MNs可能会中断ECM介导的机械通讯，并通过整合素/FAK途径抑制成纤维细胞的活化，促进ECM重塑，减少Ⅰ型胶原和纤连蛋白的分泌。

为了验证假设，作者确定了该信号通路中关键蛋白质的表达。当使用FAK抑制剂（FAKI）或是SF MNs和FAKI联合SF MNs处理成纤维细胞，与对照组相比，FAK，RhoA和F-actin的蛋白水平均显著下调。

此外，未经处理的HSF (人增生性瘢痕来源的成纤维细胞) 显示出星状形态，并完全填充了整齐的肌动蛋白网络。然而， SF MN 处理后的 HSF 形态细长， F-actin较少。

当FAKI和SF MNs联用时，结果与FAKIs处理组无显著差异，说明SF MNs主要减弱FAK机械转导，减少成纤维细胞的活化。

这些结果表明，SF MNs可以通过整合素-FAK通路减少细胞内机械信号传导，从而影响细胞骨架结构和纤维ECM蛋白组成。

然后，作者通过免疫组化染色检查了与瘢痕组织中机械转导相关的蛋白质水平。在体内，ECM 的过度沉积导致含有 FAK、vinculin（即黏着斑蛋白） 和其他机械传感复合物的局灶性粘附途径激活。

如图所示，FAK/pFAK、vinculin、RhoA、TGF-β1、α-SMA的染色在对照组中以相对较高的强度广泛分布于整个瘢痕切片，相对表达水平几乎是MN处理的瘢痕或正常组织的10倍或更高。表明SF MNs通过温和的物理干预方法以极小的侵入性降低了瘢痕组织中的机械应力。

综上，生物相容性丝素蛋白微针贴片（SF MNs）可以通过无痛、微创的方式抑制增生性疤痕的形成。强调了微针作为一种低成本、有效、方便的无疤痕伤口愈合机械治疗策略的潜力。

治疗机制主要归因于：① SF MNs诱导的成纤维细胞与ECM之间的机械通讯障碍以及成纤维细胞产生的机械应力的减少。② 通过减弱整合素/FAK信号传导，SF MNs下调了关键瘢痕相关蛋白的表达，导致低应力微环境的产生，进一步减少疤痕形成。

本文转自公众号：本草墨源

文案：张春铃｜排版：董乐轩

文献原文：10.1021/acsnano.1c11016

文献链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c11016

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